国家高技术研究发展计划(2007AA021702)
- 作品数：8 被引量：34H指数：2
- 相关作者：王菊芳王小宁陈惠鹏胡显文杨忠更多>>
- 相关机构：华南理工大学军事医学科学院华东理工大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划广州市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学经济管理轻工技术与工程更多>>
- 利用绿色荧光蛋白建立包涵体变-复性新方法被引量：2
- 2010年
- 为提高常规稀释复性方法的复性效率,以重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)包涵体为模型,开发一种新的双变性-稀释复性方法。新方法选取含有精氨酸的碱性复合溶液作为第一变性剂溶解GFP包涵体,通过梯度降低变性液的酸碱度析出溶解目的蛋白,再以尿素为第二变性剂溶解析出的蛋白,随后进行稀释复性。结果显示:与常规方法比,新方法复性的绿色荧光蛋白活性收率提高至1.5～2.3倍,复性蛋白对温度、溶液酸碱度及变性剂的稳定性提高。增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP)及其融合蛋白的包涵体采用新方法进行复性,均取得80%以上的活性回收率,说明新方法对GFP系列融合蛋白的包涵体具有一定的适用性。新方法从变性剂使用与包涵体结构的关系出发,突破常规操作中变性剂单次使用的局限,既保留了简便性又提高了常规稀释复性方法的效率。
- 张颋冯延叶沈亚领金维荣杨忠王菊芳王小宁
- 关键词：大肠杆菌包涵体复性绿色荧光蛋白
- 小泛蛋白样修饰物双荧光融合蛋白及其特异性蛋白酶的原核表达及鉴定被引量：1
- 2009年
- 本实验克隆了人的4种SENP(Sentrin-specific protease)C端催化结构域、3种SUMO(Smallubiq uitin-like modifer)、ECFP(Enhanced cyan fluorescent protein)以及EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)的基因,通过RecJoin克隆技术分别成功构建SENP和ECFP-SUMO-EYFP表达载体B28和B13。将表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Westernblotting分析鉴定,并以酶切实验初步分析了SENP相对于底物ECFP-SUMO-EYFP的酶切特异性。最终,SENP3C(SENP3 catalytic domain)截短表达,SENP5C以包涵体形式表达,其他蛋白均为可溶性表达,SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)与预期相符,Western blotting方法进一步证实其为目的蛋白。酶切实验初步鉴定了SENP1C和SENP2C的酶切特异性。以上蛋白的原核表达为荧光共振能量转移实验奠定了实验基础。
- 王晓辉郭杰王菊芳李杉孙丽华王小宁吕建新
- 关键词：原核表达纯化
- 重组艰难梭菌毒素B对小鼠结肠癌CT26细胞的诱导凋亡作用
- 2009年
- 本文探讨了重组艰难梭菌毒素B(rTcdB)对小鼠结肠癌CT26细胞的诱导凋亡作用。采用不同浓度rTcdB处理CT26细胞,通过MTT法检测细胞增殖抑制率;比色法测定Caspase3活性;细胞形态学和流式细胞技术检测细胞凋亡。结果表明,rTcdB显著抑制了CT26细胞的增殖,并呈时间-剂量依赖性;Caspase3活性在处理6h后显著升高,至18h达到最大值,与对照组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜观察到典型细胞凋亡形态学变化,细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)异位到了膜外侧,细胞膜呈明亮的绿色荧光;通过流式细胞仪检测结果表明,细胞凋亡率呈时间-剂量依赖性增加。实验结果表明,重组艰难梭菌毒素B能够诱导小鼠结肠癌CT26细胞凋亡。
- 陈敏曹延粉李杉孙丽华刘婷婷王菊芳
- 关键词：艰难梭菌细胞凋亡
- 抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤被引量：2
- 2009年
- 非霍奇金淋巴瘤（non—hodgkin＇s lymphoma，NHL）绝大多数是B细胞来源的，是最常见的血液系统恶性肿瘤，是威胁人类生命的10大恶性肿瘤之一。NHL还是我国目前发病率增长速度最快的血液系统恶性肿瘤。但是许多化疗药物对NHL的治疗效果并不好。1997年，疗效更好、副作用更小的抗CD20单克隆抗体——美罗华应用于NHL的治疗中，死亡率得到控制并逐渐下降。在之后的10年时间里，人们摸索出了多种基于美罗华的治疗方案，旨在提高美罗华功效、验证其他治疗性单克隆抗体和整合多种抗体的治疗方案，并取得了长足的进步，
- 张冠一张久丁陈惠鹏胡显文
- 关键词：非霍奇金淋巴瘤血液系统恶性肿瘤CD20单克隆抗体LYMPHOMA治疗性单克隆抗体
- 全球生物制药产业概况被引量：23
- 2009年
- 以基因工程、抗体工程或细胞工程技术生产的，源自生物体内的，用于体内诊断、治疗或预防的生物技术药物，已经成为利用现代生物技术生产的最重要的产品，并成为衡量一个国家现代生物技术发展水平的一个最重要的标志，生物制药已成为制药业中发展最快、活力最强和技术含量最高的领域。从1982年第一个新生物技术药物基因重组人胰岛素上市至今，生物制药产业只有20余年历史，约有100余种产品，但这些产品在治疗肾性贫血、白细胞减少、癌症、器官移植排斥、
- 胡显文陈惠鹏张树庸
- 关键词：生物体内制药产业基因重组人胰岛素生物技术药物现代生物技术细胞工程技术
- 高表达蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST促进HepG2肝癌细胞体外增殖
- 2010年
- 为深入探讨蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST在肝癌中的作用,构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1/PTP-PEST并转染HepG2肝癌细胞,经荧光定量RT-PCR和Western blot对转染细胞进行筛选,选出稳定高表达PTP-PEST基因的细胞株,并采用MTT及Western blot对高表达PTP-PEST基因的细胞株的增殖速度和生长因子受体结合蛋白2表达量进行检测,观察到高表达PTP-PEST的细胞株内Grb2蛋白表达上调,细胞增殖速度加快.本研究表明,在HepG2肝癌细胞株内,PTP-PEST可能通过影响Grb2蛋白的表达来促进细胞增殖.
- 李妮娅李登清颜华东金维荣梁晓岳王嘉颖董辉
- 关键词：GRB2RASMAPK肝癌
- 可溶性预测模型在包涵体复性中的应用被引量：5
- 2009年
- 目的研究包涵体复性后可溶性的预测方法,区分复性类型,提高复性效率。方法利用可溶性预测模型对43个疾病相关重组蛋白的表达进行预测,并采用双变性-复性方法对表达形成的包涵体进行复性。结果预测有可溶性表达倾向的14个蛋白表达的包涵体,复性后均收率高、可溶性好。预测为高不溶性表达倾向的29个蛋白,表达的包涵体复性后高收率与低收率并存,对这两种收率包涵体特性的统计学分析显示理论等电点间存在显著性差异(P<0.05)。结论可溶性预测模型可以应用于区分包涵体复性类型,预测复性后蛋白可溶性,为提高复性效率提供了新方法。同时提示蛋白的理论等电点在模型应用中有重要作用。
- 张颋王菊芳冯延叶杨忠马骊王小宁
- 关键词：蛋白表达包涵体复性
- 小鼠白细胞介素6的克隆表达纯化及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的构建小鼠白细胞介素6(mIL-6)工程菌,通过诱导表达和纯化,得到较高纯度的重组mIL-6融合蛋白。方法提取小鼠脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增得到mIL-6基因片段,克隆入pReceiver-B56x表达载体,转化BL21,诱导表达重组蛋白,采用亲和层析纯化。结果工程菌采用LB培养基,14℃、1mmol/L的IPTG诱导,表达量占菌体蛋白总量的33.3%,部分为可溶表达。超声破碎菌体,离心后取上清液,经过亲和层析一步纯化,目的蛋白纯度达91.3%。结论构建了高效表达mIL-6的工程菌,目的蛋白部分为可溶表达,为进一步研究白细胞介素6在促进凝血、造血等方面的生物学功能以及其与疾病发生发展的相互关系,并基于此基础上的相关药物开发研究奠定了基础。
- 华江舟王菊芳王小宁
- 关键词：白细胞介素6融合蛋白纯化
