国家自然科学基金(30572147)
- 作品数：6 被引量：8H指数：1
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- 相关机构：第四军医大学西京医院第四军医大学更多>>
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- pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达被引量：1
- 2008年
- 目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。
- 马俊陈明浩窦科峰李军郑伟霍斌亮张福琴李海民
- 关键词：基因转染技术自杀基因
- 新型自杀基因linamarase/linamarin系统对人肝癌细胞HepG2体外杀伤效应及其旁观者效应的初步观察
- 2008年
- 目的:研究新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙(lis/lin)统对人肝癌细胞HepG2的体外杀伤效应。方法:应用分子克隆技术构建热带植物木薯的cDNA文库,并从中扩增出lin基因克隆至pEGFP-N1载体,构建质粒pEGFP-N1-lis。通过电穿孔法将其转染人肝癌细胞株HepG2,同时进行G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,命名为HepG2/lis,通过荧光显微镜观察、RT-PCR、Western blot鉴定lis基因的表达;采用MTT法观察不同浓度lin对已转染的HepG2的杀伤作用及旁观者效应。结果:RT-PCR和Western blot证明转染的lis基因能够在HepG2细胞中表达并产生融合蛋白lis-EGFP;低浓度lin对转染了lis基因的HepG2细胞具有明显的细胞毒效应;旁观者效应显示仅10%左右的HepG2/lis细胞与90%的HepG2细胞混合培养于lin浓度为500mg/L的培养基时,就可显示出明显的旁观者效应。结论:lis/lin自杀基因系统在lin浓度为500mg/L时对人原发性肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用和旁观者效应。
- 陈明浩马俊李海民李军李韧张福琴窦科锋
- 关键词：自杀基因旁观者效应
- 新型自杀基因1inamaras／linamarinnamarase／Inamarin的构建及对肝癌细胞MHCC97的体外杀伤效应
- 2008年
- 目的构建表达亚麻苦甙水解酶（linamarase，lis）基因的重组真核载体，建立亚麻苦甙水解酶／亚麻苦甙（linamarase／linamarin，lis／lin）肿瘤自杀基因治疗系统并检测其对肝癌细胞MHCC97的体外杀伤效应。方法将lis基因定向克隆人真核载体pEGFPN1，并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定；用电转染法将pEGFP-N1-lis转染人肝癌细胞MHCC97，通过G418筛选建立稳定表达lis的细胞系，MTT法检测lis／lin自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。结果经酶切鉴定和DNA序列测定，证明1is基因成功定向插入到pEGFP—N1载体中；G418压力筛选4周，得到稳定表达lis的MHCC97细胞，命名为MHCC97-lis。经检测，新型自杀基因系统lis／lin对肿瘤细胞有较强的杀伤作用并显示出旁观者效应。结论成功获取表达lis基因的真核表达载体，已建立显示出对肿瘤细胞的杀伤作用以及旁观者效应的自杀基因治疗系统，为进一步研究新型自杀基因lis／lin抗肿瘤作用奠定基础。
- 马俊陈明浩李海民李军李韧张福琴窦科峰
- 关键词：自杀基因
- linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究
- 2011年
- 目的构建含木薯linamarase(lis)基因的稳定转染肝癌细胞系,并对其生物学特性进行研究。方法应用PCR法从木薯的DNA中扩增出lis基因,将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒中,构建重组质粒pcDNA3.1/lis。通过脂质体法将其转染人肝癌细胞系HepG2,进行G418筛选,获得稳定转染的肝癌细胞系HepG2/lis,通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法鉴定lis在细胞中的表达;采用Lambert法对细胞内lis酶的活性进行分析;采用MTT法观察稳定转染细胞系生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠成瘤实验分析其体内成瘤特性。结果 lis基因能稳定整合于真核细胞中,并包装出具备β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。lis在细胞中的稳定表达对细胞形态、生长特性、细胞周期、体内成瘤性等生物学特征并无明显影响。结论成功构建含lis基因的稳定转染肝癌细胞系,为将lis自杀基因系统应用于肝癌的治疗提供了实验基础。
- 李军朱靓郑瑞国李海民陈明浩马俊窦科峰
- 关键词：LINAMARASE自杀基因原发性肝癌
- 新型自杀基因亚麻苦甙水解酶／亚麻苦甙系统的研究应用
- 2007年
- 亚麻苦甙水解酶／亚麻苦甙（lis／lin）系统作为一种新型自杀基因系统，为肿瘤的基因治疗提供了又一手段。研究表明，它通过水解前体药物产生氰根离子（CN^-）对靶细胞产生杀伤效应。相比较其他自杀基因系统，lis／lin自杀基因系统具有高效、无不良反应等特点，同时其旁观者效应机制也不同于其他自杀基因系统，表现出更为强大杀伤周围靶细胞的作用。因此，作为一种新型的自杀基因系统，将有希望用于肿瘤临床治疗。
- 陈明浩李海民窦科峰
- 关键词：肿瘤基因疗法自杀基因旁观者效应
- pEGFP-N1-linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MH-CC97中的表达被引量：7
- 2008年
- 目的:构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入人肝癌细胞MHCC97中表达.方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体.利用电穿孔转染体外培养的MHCC97,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测lis基因转录水平的表达;Western Blot方法验证lis蛋白水平的表达.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,酶切和测序证明pEGFP-N1-lis真核表达载体构建成功.pEGFP-N1-lis转染MHCC97细胞后,Western Blot可以检测到lis蛋白在MHCC97细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-lis,可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.
- 马俊陈明浩窦科峰李军郑伟霍斌亮张福琴李海民
- 关键词：聚合酶链反应基因转染自杀基因
