国家杰出青年科学基金(399Z5036)
- 作品数：8 被引量：24H指数：3
- 相关作者：于翠娟杨安钢王成济许彦鸣赵晶更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学唐都医院更多>>
- 发文基金：国家杰出青年科学基金国家高技术研究发展计划中国博士后科学基金更多>>
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- 截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用被引量：12
- 2003年
- 目的 :观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用 .方法 :通过反转录PCR方法获取人全长bid基因 ,再经PCR方法克隆得到截短型bid(trun catedbid ,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过间接免疫荧光 ,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况 .结果 :成功获得人bid基因 ,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体 (pcDNA3 tbid6 1 ,pcDNA3 PE tbid6 1 ) .与对照组相比 ,在转染后 1 2～ 4 8h内两种基因的表达均导致HeLa细胞发生凋亡 ,且两者活性相当 .结论
- 裘秀春于翠娟许彦鸣贾林涛曹云新王智王成济范清宇杨安钢
- 关键词：细胞凋亡HELA细胞促凋亡作用基因表达
- 重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达
- 2006年
- 目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达。方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e23sFv-PEII-tBid61/tBid76)基因。将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段。建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测。并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化。结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEII(253-364)-tBid61/tBid76)。稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中。RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达。细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常。结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。
- 裘秀春许彦鸣于翠娟赵晶孟艳玲杨彤涛龙华马保安周勇王成济杨安钢范清宇
- 关键词：TBID抗原分泌表达
- 分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶3融合蛋白对SKBr3细胞的靶向杀伤作用被引量：1
- 2003年
- 目的 探讨分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶 (caspase 3)融合蛋白对ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 将重构型人caspase 3基因亚克隆入pCMV e2 3scFv PEII PEIII相应位点 ,构建表达分泌型的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白基因的真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEII revcasp 3,转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系 ,ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达以及对人乳腺癌细胞SKBr3生长的抑制作用 ,并将重组质粒经脂质体包裹后肌肉注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用 ,间接免疫荧光检测重构型人caspase 3蛋白在瘤体的靶向分布。结果 融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤SKBr3细胞 ,肌肉注射重组质粒明显延长荷瘤裸鼠生存时间 (延长 72 % )和抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长 (抑制率为77% )。间接免疫荧光染色显示重构型人Caspase 3融合蛋白具有靶向分布。结论 分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人Caspase 3融合蛋白靶向诱导SKBr3细胞死亡。
- 张立红贾林涛于翠娟曲萍董海龙赵晶许彦鸣王成济杨安钢
- 关键词：分泌表达融合蛋白靶向杀伤作用CASPASE-3基因疗法
- 重构型caspase-3的表达及其对SKBr3细胞的凋亡诱导作用被引量：2
- 2002年
- 目的:探讨重构型caspase-3基因的表达对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。方法:用重组PCR的方法获得大、小亚基顺序颠倒的重构型caspase-3基因并将其克隆入真核表达载体pcDNA3,转染乳腺癌细胞系SKBr3细胞,通过HE染色、流式细胞仪分析及免疫组化等方法观察其表达后对细胞的促凋亡活性,并将载体DNA直接注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用。结果:重构型caspase-3基因可在SKBr3细胞内表达,转染组较同期对照组出现明显的细胞死亡现象,pcDNA3-revcasp-3重组质粒直接注入对荷瘤裸鼠肿瘤生长有明显抑制作用。结论:重构型caspase-3基因表达可诱导SKBr3细胞凋亡。
- 张立红贾林涛陈广生曲萍于翠娟赵晶许彦鸣王成济杨安钢
- 关键词：凋亡SKBR3乳腺癌肿瘤细胞
- 截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究被引量：8
- 2004年
- 目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论
- 裘秀春于翠娟孟艳玲许彦鸣赵晶金明王成济范清宇杨安钢
- 关键词：细胞凋亡绿色荧光蛋白HELA细胞
- 重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。
- 裘秀春许彦鸣马保安周勇单乐群杨彤涛于翠娟孟艳玲杨安钢范清宇
- 关键词：腺病毒表达载体LACZ
- 单链抗体融合重构型人caspase-3蛋白的靶向抑瘤作用研究被引量：3
- 2003年
- 目的 :探讨分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白对ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 :将重构型人caspase 3基因亚克隆入 pCMV e2 3scFv PEⅡ PEⅢ相应位点 ,构建表达分泌型的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白基因的真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEⅡ revcasp 3,转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系 ,ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达。用含有该融合蛋白的培养介质培养人宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞SKBr3以及人卵巢癌细胞SKOV3等研究该蛋白对细胞生长的抑制作用 ;将转染建系的Jurkat细胞尾静脉注射SKBr3荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用 ,间接免疫荧光检测重构型人caspase 3蛋白在瘤体的靶向分布。 结果 :融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤ErbB2抗原阳性的SKBr3和SKOV3细胞而对ErbB2抗原阴性的Hela细胞生长无明显影响 ,尾静脉注射该细胞可靶向抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长。结论 :分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白靶向诱导ErbB2抗原阳性肿瘤细胞死亡。
- 张立红贾林涛于翠娟鲍炜金明赵晶王成济杨安钢
- 关键词：HELASKBR3SKOV3
- 抗HER2单链抗体融合凋亡蛋白对SKOV3细胞的靶向杀伤被引量：5
- 2003年
- 目的 :探讨分泌表达的抗HER2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白对HER2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 :将重构型人caspase 3基因亚克隆入pCMV e2 3scFv PEII PEIII的相应位点 ,构建重组真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEII revcasp3,并转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系。用ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达。通过共培养实验观察含有该融合蛋白的培养上清对人卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用。结果 :融合蛋白基因可在Jurkat细胞中 ,分泌表达并杀伤SKOV3细胞。结论 :分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase
- 张立红贾林涛鲍炜于翠娟赵晶金明王成济杨安钢
- 关键词：天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶HER-2SKOV3细胞靶向杀伤作用
