浙江省科技计划项目(2003C34010)
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
- 相关作者：毛亚飞严杰徐水凌罗冬娇颜丹红更多>>
- 相关机构：浙江大学嘉兴学院杭州师范大学更多>>
- 发文基金：浙江省科技计划项目嘉兴市科技计划项目浙江省教育厅科研计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- sea基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性的研究被引量：3
- 2007年
- 目的构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因及其突变体原核表达系统,了解突变前后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化。方法采用高保真PCR和T- A克隆法,从金黄葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的sea基因。采用突变引物PCR构建sea基因定位突变体。建立sea基因及其定位突变体原核表达系统。Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白。采用TCID_(50)法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性。采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用。结果所克隆的sea基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100%,7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变。rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52%。rSEA对Vero细胞TCID_(50)为4.1μg,其突变体重组蛋白分别为5.8～23.5μg。1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用(P<0.05),10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似(P>0.05)。5～20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长(P<0.05)。结论本研究成功地构建了sea基因突变体及其高效原核表达系统,其表达产物的细胞毒性均有所降低。由于rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体。
- 范芳华严杰毛亚飞
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A
- 葡萄球菌肠毒素B基因原核表达系统的构建及其表达产物促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的研究被引量：1
- 2006年
- 构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B，SEB）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段，T—A克隆后测序，构建SEB基因原核表达系统pET32α-SEB—E．coliBL2IDE3．采用SDS-PAGE检测rSEB表达产量，Ni—NTA亲和层析法提纯rSEB．采用TCID50法测定rSEB对Vero细胞的细胞毒性作用并计算TCID50值．采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEB体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝腺癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用．与公布的相关序列比较，所克隆的SEB基因核苷酸序列相似性为100％．rSEB表达量约为细菌总蛋白的40％．rSEB对Vero细胞的TCIC50为3．02μg．5．0～20．0μg／ml的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P〈0．05）．5．0～20．0μg／ml rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P〈0．05）．本研究成功地构建了rSEB高效原核表达系统．rSEB仍然具有生物学活性．所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEB突变体的筛选奠定了基础．
- 毛亚飞徐水凌罗冬娇严杰
- 关键词：葡萄球菌肠毒素B
- 葡萄球菌肠毒素A基因的克隆、原核表达和鉴定被引量：3
- 2006年
- 目的克隆葡萄球菌肠毒索A(SEA)基因,构建其原核表达系统,鉴定重组蛋白(rSEA)免疫原性。方法采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建pET32a-SEA表达质粒,转化入E.coli BL21DE3宿主菌,通过IPTG诱导表达,分离、纯化及Western印迹法鉴定。结果PCR获得SEA基因片段,DNA测序结果与已报道的SEA基因序列(GenBank No:L22566,AP004828)一致,构建了pET32a-SEA表达质粒,并成功地诱导、纯化了rSEA蛋白,rSEA表达量约为细菌总蛋白的40%。结论成功克隆了SEA全长基因,构建了rSEA原核表达系统,为进一步研制SEA的单克隆抗体及诊断试剂盒奠定了基础。
- 徐水凌毛亚飞颜丹红项洪琴
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A基因克隆原核表达
- 重组葡萄球菌肠毒素B蛋白表达、纯化及生物活性的实验研究
- 2008年
- 目的建立重组葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)表达、纯化方法,了解rSEB细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法采用IPTG(1.0mmol.L-1)诱导SEB原核表达系统pET32a-SEB-E.coliBL21DE3表达rSEB,10%SDS-PAGE检测其产量,Ni-NTA亲和色谱法纯化rSEB。采用Vero细胞测定rSEB的细胞毒性作用,并计算TCIC50值。通过MTT法分别检测不同浓度rSEB体外促淋巴细胞增殖作用,以及对肿瘤细胞株HepG2、HeLa的生长抑制作用。结果所构建的SEB原核表达系统中,rSEB表达量约为细菌总蛋白的40%,主要以包涵体形式存在。纯化的rSEB对Vero细胞的TCIC50为3.02μg。5.0～20.0mg.L-1的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用(P<0.05)。5.0～20.0mg.L-1rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长(P<0.05)。结论建立了SEB高效表达、纯化方法,获得rSEB蛋白。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为后续进一步分析SEB分子中相关活性位点及其减毒SEB突变体的筛选奠定了基础。
- 徐水凌毛亚飞漆秋兰严杰
- 关键词：葡萄球菌肠毒素B重组蛋白细胞毒性淋巴细胞增殖抑制肿瘤细胞
- 葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定被引量：2
- 2007年
- 目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因原核表达系统,了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法:采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID50法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC50值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞(PBMC)的促增殖作用以及对HepG2细胞(人肝癌细胞)、HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)的生长抑制作用。结果:与公布的相关序列比较,所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC50为3.14μg。1.0-20.0mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用(P<0.05)。5.0-20.0mg/LrSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长(P<0.05)。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。
- 徐水凌毛亚飞张梅光罗冬娇严杰
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A原核表达HEPG2细胞HELA细胞
- 葡萄球菌肠毒素B基因真核表达系统的构建及目的蛋白的鉴定被引量：2
- 2004年
- 目的 克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因 ,构建其真核表达系统并表达目的蛋白。方法 采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB ,目的片段T A克隆后测序。重组质粒pUCm T SEB经酶切获得的pUCm T SEB基因片段与真核表达载体pPIC9K连接。将重组真核载体pPIC9K SEB转化入P .pastorisGS115株 ,经PCR筛选并鉴定pPIC9K SEB P .pastorisGS115。在 0 5 % (v v)甲醇诱导下 ,采用SDS PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达 ,并对rSEB的N端氨基酸序列和诱导人脐静脉内皮EVC 30 4细胞分泌IL 1α和TNFα的作用进行了检测。结果 所克隆的SEB基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别高达 98 84 %～ 10 0 %和 10 0 %。表达的SEB在SDS PAGE图谱的位置与预期相符。rSEB氨基末端氨基酸序列与预期完全相符。rSEB与SEB商品有相似的促人脐静脉内皮细胞EVC 30 4分泌IL 1α和TNFα的活性。结论 已成功地构建了SEB的真核表达系统 ,为进一步分析SEB分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。
- 孙爱华毛亚飞严杰
- 关键词：葡萄球菌肠毒素B真核表达系统蛋白突变体
- 葡萄球菌肠毒素A促白细胞增殖与抗肿瘤活性的研究现状
- 2005年
- 孙爱华毛亚飞严杰
- 关键词：T细胞增殖抗肿瘤活性葡萄球菌肠毒素A金黄色葡萄球菌肠毒素细胞毒作用升白细胞
