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2型猪链球菌RevS基因敲除突变株生物学特征及致病性研究: 2018年; 比较2型猪链球菌(S.suis 2)ΔRevS突变株和05ZY/H33野生株生物学特性及致病性的差异.首先,通过吸光值测定和革兰染色比较△RevS突变株和05ZY/H33野生株的生长速度和菌体形态.分别对Balb/c及ICR(CD1)小鼠腹腔注射109 CFU·mL^(-1)的05ZY/H33菌液,评估两种品系小鼠对S.suis 2的易感性.分别对Balb/c小鼠腹腔注射2.5×10~9,5.0×10~8,1.0×108,2.0×10~7,4.0×10~6 CFU·mL^(-1)的05ZY/H33菌液,采用Reed法计算半数致死量.对Balb/c小鼠腹腔注射5.0×108 CFU·mL^(-1)的ΔRevS突变株和05ZY/H33野生株菌液,观察野生株和突变株对小鼠的影响.对仔猪耳缘静脉注射10~9 CFU·mL^(-1)的05ZY/H33野生株和ΔRevS突变株菌液,观察野生株和突变株对仔猪的影响.体外生物学特征分析表明,与野生株相比,突变株的生长速率和形态染色并未发现显著变化;Balb/c小鼠对S.suis 2 05ZY/H33的敏感性高于ICR(CD1)小鼠,05ZY/H33对Balb/c小鼠的LD50为4.2×10~7 CFU·mL^(-1).Balb/c小鼠攻毒试验结果显示,ΔRevS对小鼠的致病性明显减弱.仔猪攻毒试验结果显示,野生株和突变株都引发仔猪全部死亡,但ΔRevS引发仔猪死亡时间较晚.△RevS突变株保持了菌株的基本生物学特征,但对小鼠和仔猪两种动物模型的致病作用差异较大.; 孙雯郑峰; 关键词：半数致死量

2型猪链球菌β-半乳糖苷酶基因的克隆表达及酶活性测定被引量：4: 2014年; 目的:克隆表达2型猪链球菌β-半乳糖苷酶(BgaC)编码基因,并测定其酶活性。方法:根据05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增bgaC基因,构建重组表达质粒pET28a-bgaC,转化E.coli BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE鉴定;最后对表达产物进行亲和层析纯化,获得BgaC纯化蛋白后测定其酶活性。结果:bgaC基因在原核细胞中得到高效表达,重组表达的BgaC分子质量约为69kDa,其酶促反应最适温度为42℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH为5.5,最佳底物浓度为10mmol/L。2型猪链球菌BgaC的体外酶活为1615U/ml,酶比活为1076U/mg。结论:2型猪链球菌强毒力株05ZYH33中含有bgaC基因,在原核系统高效表达的BgaC具有良好的酶学活性。; 张凤玉胡丹龚秀芳郑峰潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌 Β-半乳糖苷酶酶活性 STREPTOCOCCUS SUIS SEROTYPE

四川S.suis 2强毒株溶血素样蛋白HLP序列信息分析及克隆表达产物活性检测被引量：1: 2016年; 对四川猪链球菌2型(S.suis 2)强毒株05ZYH33溶血素样蛋白(hemolysin-like protein,HLP)编码基因hlp进行序列信息分析、分子克隆表达及溶血活性检测,深入探讨HLP的致病机制.用Blast和Clustal X程序对HLP进行基因同源性分析,用Signal P 4.1和TMHMM Server 2.0分析HLP氨基酸序列.设计合成hlp引物进行PCR扩增,先后将hlp克隆入p MD-18T载体和p ET30a表达载体中,构建p ET30a::hly原核表达质粒.将重组质粒转化至E.coli BL21中诱导表达,并对重组HLP蛋白进行纯化和溶血活性检测.同源性分析表明HLP与多种具有溶血活性的蛋白相似性较高.氨基酸序列分析发现HLP具有信号肽和跨膜区,且由DUF21、CBS和Cor CHly C 3部分组成.序列测定显示hly片段全长1 335 bp,编码445个氨基酸.重组质粒经诱导表达和纯化后电泳显示,HLP分子量约为70 k Da,具有溶血活性.结果表明,HLP是一个膜结合蛋白,不同于能够分泌到细胞外的溶血素Suilysin.重组HLP具有一定的溶血效价,此可能与致病相关.; 孙雯郑峰; 关键词：同源性分析分子克隆溶血活性

S.suis 2中国强毒株烯醇化酶Enolase基因的分子克隆及蛋白生物功能研究被引量：1: 2017年; 对中国强毒株S.suis 2烯醇化酶Enolase进行克隆表达、定位分析、酶活性检测及免疫相关功能研究,探讨Enolase在S.suis 2致病中的作用。基于S.suis 2 05ZYH33全基因组测序,对Enolase编码基因进行生物信息学分析。构建pET32a∷eno重组表达质粒,转化入E.coli BL21中诱导表达,利用His-Beads和FPLC纯化后获得Enolase重组蛋白。对纯化后的Enolase进行酶活性检测,鉴定其糖代谢功能。然后利用FCM分析Enolase在S.suis 2的定位情况,最后通过外周血单核细胞MTT实验检测Enolase对PBMCs活性的影响。同源性分析发现S.suis 2 eno与多种细菌中eno高度同源。SignalP和TMHMM分析发现Enolase没有信号肽也没有跨膜区。eno分子克隆并测序显示长度为1 308 bp。重组质粒经诱导表达并纯化后,获得75 kD的Enolase蛋白。纯化的重组Enolase有将2-PEG转化成PEP的能力。FCM分析表明Enolase也存在于细菌表面。MTT测试表明Enolase能够引发PBMCs活性的下降。Enolase不仅在S.suis 2体内参与基础代谢活动,同时也存在于S.suis 2表面,可能通过破坏单核细胞参与感染过程。; 孙雯郑峰; 关键词：烯醇化酶外周血单核细胞

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国家自然科学基金(31300119)