目的:通过观察丝状肌动蛋白(F-actin)在不同阶段凋亡、坏死毛细胞中的变化,揭示噪声性耳蜗毛细胞损伤早期的细胞形态学特征。方法:青年SD大鼠20只,接触噪声暴露的实验组及未接触噪声暴露的正常对照组动物各10只。将动物暴露于110 dB SPL,4 kHz窄带噪声,持续暴露8 h。稳态噪声暴露后接触155 dB SPL的脉冲噪声75次。噪声暴露前及噪声暴露后即刻、2周应用电反应测听仪检测不同频率短纯音(5、10和20 kHz)诱发的动物双侧听性脑干反应阈值(ABR)。听觉功能检测后处死动物,解剖取双侧耳蜗。采用DNA荧光染料碘化丙锭(PI)标记毛细胞核,异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色毛细胞纤毛、表皮板的丝状肌动蛋白。以对照组动物耳蜗为对照,荧光显微镜下观察噪声暴露后大鼠耳蜗不同程度核固缩、核肿胀毛细胞的纤毛、表皮板F-actin表达的变化。结果:噪声暴露后即刻和2周不同频率短纯音诱发的ABR阈值均升高。荧光显微镜下观察发现,外毛细胞核肿胀时未见F-actin染色的改变;外毛细胞核型正常,但PI染色加深时,也未见F-actin的变化。外毛细胞核轻微固缩时,F-actin表达正常或轻度增强。外毛细胞核中度、重度毛细胞固缩时,F-actin染色变浅;外细胞核完全消失后,F-actin表达明显减弱或消失。结论:噪声暴露后耳蜗中凋亡、坏死的外毛细胞核变化早于纤毛及表皮板。F-actin可能在毛细胞凋亡中存在聚合和解聚2个过程,但其与毛细胞坏死过程无关。
目的观察噪声损伤后耳蜗外毛细胞内单链DNA和EndoG的变化,探讨耳蜗外毛细胞的死亡机制。方法豚鼠随机分为噪声暴露组、MNNG耳蜗灌流组和对照组(每组各12只);小鼠随机分为噪声暴露组和对照组(每组12只)。分离解剖耳蜗后,用碘化丙啶(PI)染色细胞核、Pholloidin染色F-actin,免疫荧光抗体分别染色单链DNA(ssDNA)、核酸内切酶G(Endonuclease G EndoG)和凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factors,AIF),制备耳蜗铺片,激光共聚焦显微镜下观察凋亡和坏死毛细胞内的荧光信号变化。结果(1)暴露于120dBSPL的白噪声环境中每天4小时,连续2天后引起豚鼠和小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时,其细胞核内产生ssDNA,而在正常细胞内没有三ssDNA;(2)在正常情况下,EndoG分布于耳蜗毛细胞的细胞核外,在暴露于上述噪声后发生凋亡和坏死的豚鼠耳蜗外毛细胞中,EndoG从细胞核外转移到细胞核内,细胞核中的EndoG显著增加;(3)豚鼠耳蜗外淋巴灌流烷化剂MNNG后发生耳蜗外毛细胞凋亡和坏死,在凋亡和坏死的耳蜗外毛细胞中,AIF自线粒体转移到细胞核,其变化与噪声损伤引起耳蜗外毛细胞凋亡和坏死时一致。结论噪声刺激或烷化剂MNNG灌流后,造成耳蜗外毛细胞DNA损伤,产生ssDNA,引起AIF和EndoG自线粒体释放,激活Caspase-3,AIF和EndoG进一步向细胞核转移,最终使细胞核内的DNA降解,导致耳蜗毛细胞的死亡。
