国家自然科学基金(81100441)
- 作品数：9 被引量：41H指数：4
- 相关作者：马佳佳陈必良张建芳蔡国青杨红更多>>
- 相关机构：第四军医大学西京医院连云港市东方医院更多>>
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- 34例胎膜早破孕妇妊娠晚期阴道微生态及免疫因子变化状况分析被引量：8
- 2013年
- 目的:胎膜早破是一种常见但发生机制十分复杂的妊娠并发症。在所有的早产儿中,孕妇胎膜早破的比例高达33%。本研究针对胎膜早破产妇妊娠晚期阴道微生态及免疫因子的变化情况,分析阴道内菌群失调或局部免疫反应与胎膜早破的关系,为临床研究提供实验数据。方法:回顾性分析我院于2010年7月-2013年3月收治的34例胎膜早破孕妇的临床资料,同时选取于我院进行健康体检的妇女及产前检查的健康孕妇各34例作为对照。采集所有研究对象的阴道分泌物,对比分析各组样本中病原微生物的分布及免疫因子的浓度。结果:胎膜早破组乳酸杆菌的检出率要明显低于健康妇女组与健康孕妇组(79.4%vs 70.6%vs34.1,X2=8.438,P<0.05),三组研究对象其他菌属分布的差异比较无统计学意义(P>0.05);胎膜早破组阴道分泌物IL-6浓度与TNF-α浓度要显著高于健康妇女组与健康孕妇组(P<0.05)。结论:胎膜早破产妇阴道内的菌群分布与健康女性及孕妇有所不同,阴道内菌群失调及局部的免疫反应可能会导致胎膜早破的发生。
- 顾金云徐艺杨红刘淑娟蔡国青
- 关键词：胎膜早破阴道微生态免疫因子
- 靶向沉默Gata3对妊娠期哮喘小鼠树突状细胞表型及效应T细胞失衡表达的影响
- 2014年
- 目的:研究慢病毒介导siRNA靶向沉默Gata3基因表达对妊娠哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)抗原递呈及其免疫生物学特性的影响。方法:以脂质体DNA沉淀法将重组慢病毒干扰质粒与包装质粒共转染AD293细胞,包装生成慢病毒感染体外诱导DC,RT-PCR、Western blot分析其对siGata3基因的整合转录效果;流式细胞术观察细胞表型变化。通过尾静脉注射将pSH1/siGata3转移至小鼠体内,ELISA法测定其肺泡灌洗液(BALF)中的炎性因子含量;MTT法验证混合淋巴细胞反应(MLR)后T细胞增殖能力。结果:经重组、包装携有Gata3特异siRNA慢病毒感染DC成功,其siRNA靶点Gata3 mRNA及蛋白的转录表达分别下调87.30%和81.33%(P<0.05);同时降低DCs膜表面CD86荧光强度(P<0.05)。减少pSH1/siGata3组小鼠BALF中IL-5、IL-17分泌而提升IL-12水平(P<0.05);MLR证实,共培养感染DC激活T细胞的能力明显不足(P<0.05)。结论:siRNA干扰可有效抑制模型小鼠免疫微环境特定Gata3通路,阻遏T细胞及其亚群分化由此来诱导DC免疫耐受,为妊娠期哮喘防治奠定基础并提供新的思路和手段。
- 马佳佳陈必良Nick Lu
- 关键词：哮喘树突状细胞免疫耐受
- 重组IL-12表达载体构建及对妊娠期哮喘小鼠气道炎症的调节与免疫应答影响
- 2013年
- 目的:构建携带IL-12重组基因的真核表达载体,探讨其对妊娠期哮喘小鼠气道炎症的免疫调节作用及其可能机制。方法:PCR扩增mIL-12基因cDNA,利用DNA重组技术将线性化片段定向插入载体pcDNA3.1(+)质粒中,经酶切和测序鉴定,通过脂质体介导瞬时转染P815细胞,观察荧光蛋白在细胞中的表达和定位。以鸡卵清蛋白(OVA)致敏和激发建立妊娠期哮喘小鼠模型,通过气道内灌注:妊娠期哮喘(AP)+pcDNA3.1(+)-mIL-12组(AP1组)、单纯哮喘(ANP)+pcD-NA3.1(+)-mIL-12组(ANP1组)给予50μl pcDNA3.1(+)-mIL-12/脂质体混合液;AP+pcDNA3.1(+)组(AP2组)、ANP+pcDNA3.1(+)组(ANP2组)给予50μl pcDNA3.1(+)/脂质体混合液;单纯妊娠组(HP组)、阴性对照组(HNP组)给予50μlPBS。于末次激发24小时后,观察肺泡灌洗液(BALF)炎性细胞计数及肺组织HE染色以评价小鼠气道炎症程度;RT-PCR、Western blot鉴定小鼠肺组织匀浆中IL-12蛋白及mRNA表达;流式细胞术检测小鼠脾细胞IL-17+及IFN-γ+分泌水平;ELISA测定小鼠外周血上清中细胞因子含量变化。结果:成功构建重组pcDNA3.1(+)-mIL-12真核表达载体,并在P815细胞中获得高效表达。与HP、HNP组相比,AP1、ANP1组BALF中白细胞总数及Eos,Neu,Lym占细胞总数百分比均显著低于AP2、ANP2组,但高于HP和HNP组,AP1与ANP1组间尤以AP1组降低显著(P<0.05),且肺组织炎症细胞浸润明显减轻,炎症反应明显轻微。肺组织标本中,AP1、ANP1组IL-12蛋白含量及mRNA表达水平在重组质粒干预后显著高于AP2、ANP2组。脾组织标本中AP1、ANP1组IFN-γ+含量明显升高,而CD4+IL-17+明显降低(P<0.05);IFN-γ+与CD4+IL-17+比例高于AP2、ANP2组(P<0.05);此变化趋势AP1组比ANP1组更为明显(P<0.05);HP组IFN-γ+及IL-17+含量变化与HNP组组间差异不显著。外周血上清中细胞因子检测结果 AP1、ANP1组IFN-γ明显升高,IL-4、IL-17显著降低(P<0.05)。结论:构建的pcD-NA3.1(+)-mIL-12真核表达载体能够在明显改善妊
- 马佳佳Nick Lu陈必良滑玮张建芳
- 关键词：白细胞介素12妊娠哮喘
- CD4^+T细胞亚群表达失衡在妊娠期哮喘发病中的作用及意义被引量：3
- 2012年
- 目的:观察妊娠期哮喘小鼠模型中Th17及Treg细胞活性分布和表达变化,探讨Th17/Treg细胞免疫平衡在妊娠期哮喘小鼠发病中的作用机制。方法:24只6～8周龄,雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组6只。以OVA/Al(OH)3混悬液致敏与激发构建妊娠期哮喘组(AP组)和非妊娠期哮喘组(ANP组)小鼠模型;健康妊娠组(HP组)和健康非妊娠组(HNP组)小鼠致敏与激发均以只含Al(OH)3的生理盐水混悬液替代。光镜下观察小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数及分类;HE染色评价小鼠气道炎症程度及肺组织病理学变化;流式细胞术测定小鼠外周血Th17及Treg细胞所占CD4+T细胞比例,计算Th17/Treg细胞比值;RT-PCR检测小鼠肺组织中Th17及Treg细胞相关因子表达。结果:妊娠期哮喘小鼠BALF中炎症细胞分类及计数、肺组织病理学表现和活体肺功能气道高反应性Penh值等客观指标证实,妊娠哮喘小鼠模型构建成功。外周血中,AP组CD4+IL-17+T细胞(Th17)显著升高(P<0.01);Foxp3+T细胞(Treg)显著降低(P<0.01);与HP,HNP组相比,存在Th17/Treg比例失衡(P<0.01)。AP组小鼠肺组织中IL-17、IL-23,IL-10 mRNA表达水平均显著高于HP组及HNP组(P<0.01);IFN-γmRNA则显著低于HP组及HNP组(P<0.01);ANP组各因子mRNA水平变化与AP组一致,组间无显著差异。结论:妊娠期哮喘小鼠存在细胞免疫功能失调;Th17、Treg细胞数量及免疫平衡状态发生改变,可能是妊娠期哮喘发病过程中一个重要的决定因素。
- 马佳佳Nick Lu陈必良
- 关键词：哮喘T-淋巴细胞调节性T淋巴细胞
- 表达白介素-23基因的重组纯化及其对妊娠期哮喘气道炎症状态下免疫应答产生的影响被引量：4
- 2014年
- 目的研究IL-23融合基因免疫调节及其生物学功能与妊娠期哮喘气道炎症的相关性。方法用构建表达IL-23p40+p19双亚基真核表达质粒转化E.coil BL21菌,IPTG诱导表达产物纯化后,通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法进行检测;荧光显微镜及Western blot法鉴定重组蛋白介导质粒转染结果,凝胶电泳迁移实验测定核蛋白的DNA结合活性变化;ELISA法、HE染色分析外源蛋白体内转移对小鼠血清炎性因子水平及肺组织炎症损伤影响;流式细胞术验证外周血单个核细胞中CD4+T细胞亚群比例。结果成功获得可溶性重组外源蛋白可跨膜转运,并有效介导EGFP进入目标细胞,其稳定表达及转录活性均高于单纯质粒转染效应;GST/pCEP4-IL-23特异结合质粒DNA形成大分子复合体使凝胶迁移率降低;与LPS共同作用,明显增加致敏小鼠血清IL-17A含量(P<0.05)和肺组织炎症病理反应程度;降低患者外周血IFN-γ、Foxp3水平,促进IL-4、IL-17A活化,进而升高Th2/Th1和Th17/Treg比值(P<0.05)。结论重组IL-23蛋白具有致病性,参与妊娠哮喘炎症调控,CD4+T亚群免疫失衡共同对妊娠母体免疫耐受及疾病发生发展产生影响。
- 马佳佳Nick Lu陈必良
- 关键词：真核表达基因转移哮喘妊娠
- IL-17R-FcγRⅡb基因体外诱导树突状细胞表达及其对淋巴细胞增殖活化的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:构建编码人全长IL-17R与FcγRⅡb双基因表达重组腺病毒载体并对其特性进行鉴定,探讨阻断其信号调节通路对妊娠哮喘发病的影响。方法:将扩增出的拼接基因片段定向克隆于pAdTrack-CMV中经与pAdeasy-1同源重组,鉴定正确的阳性重组子通过脂质体介导转入AD293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光(GFP)信号并采用PCR法对其进行鉴定;纯化腺病毒感染体外细胞因子协同诱导培养的妊娠哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞(DC),利用RT-PCR、Western免疫印迹检测IL-17R和FcγRⅡb表达;流式细胞术、CCK-8、ELISA分析重组腺病毒的修饰对DC表面分子表达,刺激T细胞增殖抑制变化和MLR上清中IFN-γ、IL-4、IL-17分泌水平影响。结果:构建的重组腺病毒载体插入序列完全正确;经GFP表达和PCR检测证实成功包装获得高滴度重组腺病毒;感染DCs的GFP阳性细胞数达到85%;在mRNA及蛋白水平均可同时转录和表达出符合预期的IL-17R和FcγRⅡb。CD11c阳性表达率在各组间无显著差异;与对照细胞及EGFP-DCs相比,经IL-17RFcγRⅡb修饰的DC表面CD80表达增高,而CD86表达减少(P<0.05);IL-17R-FcγRⅡb-DCs相同浓度比例刺激T细胞增殖水平均明显受抑(P<0.05);转染载体共培养物上清液中Th2/Th17类细胞因子IL-4、IL-17水平下降,Th1类细胞因子IFN-γ升高(P<0.05),IFN-γ/IL-4/IL-17相对比值增加(P<0.05)。结论:IL-17R-FcγRⅡb融合基因体外阻断CD86/CD28共刺激通路可诱导DC免疫耐受状态,抑制抗原特异性T细胞增殖并影响Th1/Th2/Th17亚群分化,有望在妊娠哮喘免疫耐受缺陷和缓解气道炎症反应中发挥作用。
- 马佳佳Nick Lu陈必良
- 关键词：免疫球蛋白G
- 人可溶性sTNFR1及胞膜外区Ig融合基因重组腺病毒的真核表达及功能活性鉴定
- 2013年
- 目的构建携带人sTNFR1与IgGFc片段融合基因的重组腺病毒,稳定表达并初步鉴定其功能活性在妊娠哮喘炎症机制中的作用。方法将PCR扩增的sTNFR1及IgGFc基因片段先后连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点上,酶切线性化后在BJ5183细菌内与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,产生获得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂质体法转染AD293细胞进行病毒包装,以绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度及感染效率。RT-PCR、Western blot实验鉴定细胞内重组腺病毒转录及融合基因与蛋白表达;流式细胞术、ELISA实验分析混合培养上清中转染肥大细胞(MC)激活、调节同基因来源T细胞表达Th2/Treg水平及细胞因子分泌效果;MTT评估转染细胞上清中sTNFR1-Ig对TNF-α介导细胞毒效应的拮抗作用。结果成功构建编码sTNFR1-Ig基因的重组腺病毒载体经酶切和测序鉴定正确,制备的腺病毒在转染细胞中的GFP表达以及CPE效应明显,扩增后的滴度为3.7×1010～4.8×1010pfu/ml,体外感染效率可达90%以上;sTNFR1-Ig基因在mRNA及蛋白水平获得的清晰条带均证实腺病毒包装与扩增成功。表达sTNFR1-Ig的MC诱导T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平以及IL-12含量均明显升高,CD4+IL-4+Th2细胞水平下调(P<0.05),Th2/Treg所占CD4+T细胞比值下降(P<0.05)。sTNFR1-Ig封闭TNF-α对MC免疫毒性作用的浓度效应明显,而EGFP-MCs与对照细胞上清对TNF-α毒性效应的中和阻断能力不足(P<0.05)。结论携sTNFR1-Ig基因重组腺病毒参与的免疫调控与妊娠期哮喘发生发展密切相关。sTNFR1及IgG-Fc亚基胞膜外区结合的表达和引起免疫耐受的作用研究,为妊娠哮喘发病机制在理论上的新突破,为以sTNFRI-Ig为靶点的妊娠哮喘干预治疗奠定基础。
- 马佳佳Nick Lu陈必良
- 关键词：免疫球蛋白G真核表达
- 转录因子RORγt对妊娠期哮喘模型小鼠Th17/Treg平衡的调节作用被引量：20
- 2012年
- 目的观察妊娠期哮喘模型小鼠Th17细胞相关细胞因子和维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)的表达变化,探讨地塞米松(DXM)对小鼠气道炎症和Th17细胞分泌功能的影响。方法 30只雌性BALB/c小鼠随机分为健康妊娠(HP)组、妊娠期哮喘(AP)组和地塞米松(DXM)组,每组10只。AP组和DXM组于实验当天(0d)和7、14d时分别给予OVA/Al(OH)3混悬液腹腔注射致敏,HP组仅给予单纯等量生理盐水(NS)。3组小鼠合笼交配至妊娠成功。于21d起,连续7d对AP组和DXM组给予50g/L OVA雾化激发(1次/d,40min/次);DXM组于雾化吸入OVA前30min给予1mg/kgDXM腹腔注射;HP组仅给予单纯等量NS进行雾化激发。各组小鼠于末次激发24h后进行气道反应性检测,结果以相应浓度乙酰胆碱(Mch)激发下增强的呼吸间歇(Penh)值与基线值的百分比[Penh值(%)]来表示;分析支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及分类计数;取肺组织行病理学观察;采用流式细胞仪检测外周血Th17和Treg细胞的比例并计算Th17/Treg比值;ELISA法测定外周血IL-17、IL-23、IFN-γ和RORγt含量,RT-PCR法检测前述因子在肺组织中的表达,Western blotting检测肺组织中RORγt的表达。结果雌性BALB/c小鼠以OVA致敏后气道反应性增加,BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞(Eos)、淋巴细胞(Lym)和中性粒细胞(Neu)比例增加,肺组织病理学改变符合哮喘的特征。外周血标本中,AP组Th17细胞显著升高,Treg细胞显著降低(P<0.05),Th17/Treg比值上升。DXM组Th17和Treg细胞变化趋势与AP组相同,Th17/Treg比值高于HP组,但低于AP组(P<0.05)。分别在肺组织和外周血标本中检测蛋白和mRNA表达水平,结果显示,AP组IL-17、IL-23及RORγt含量均高于HP组及DXM组(P<0.05),IFN-γ含量低于HP组及DXM组(P<0.05)。AP组肺组织RORγt蛋白的表达(61.27%±3.11%)明显高于DXM组(37.51%±1.93%,P<0.01)和HP组(22.39%±0.86%,P<0.01),后两者比较差异亦有统计学意义(P<0.01)。相关分析表明,AP组肺
- 马佳佳Nick Lu陈必良
- 关键词：哮喘妊娠CD4阳性T淋巴细胞TH17细胞
- 剖宫产术后对母婴早接触早吸吮的影响因素分析及对策被引量：5
- 2014年
- 目的:分析剖宫产术后影响母婴早接触早吸吮的因素及干预措施,为改善产妇泌乳量,提高哺乳质量提供理论基础。方法:选取2010年2月~2012年2月我院进行剖宫产手术的92例初产妇,按照随机数字表分为对照组和干预组,对照组采用常规的护理措施,干预组在对照组的基础上实施母婴早接触早吸吮护理措施,比较两组护理后的临床疗效。结果:对照组产妇的开奶时间为(47.8±7.1)h,而干预组为(35.6±8.6)h,干预组产妇的开奶时间明显早于对照组,且干预组产妇72h泌乳量较对照组产妇充足,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:针对母婴早接触早吸吮的相关影响因素,采取相应的护理干预措施可以明显促进产妇的早期恢复和泌乳,提高产妇的泌乳量和母婴的早接触早吸吮,值得在临床上推广。
- 韩宁宁任红张建芳段利利陈颖
- 关键词：剖宫产术产妇干预措施
