国家自然科学基金(30470613)
- 作品数：8 被引量：10H指数：2
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- 大鼠干扰素诱导蛋白-10的体外表达和鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)真核表达载体,在NIH3T3细胞中表达重组载体pcDNA3.1(+)-IP-10,并对其表达产物进行鉴定。方法通过PCR扩增IP-10基因片段,通过酶切和连接反应,构建IP-10的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-IP-10在NIH3T3细胞的表达情况。转染的NIH3T3细胞通过G418筛选出稳定表达的细胞克隆,Western Blotting鉴定IP-10蛋白在细胞培养上清的表达情况。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组载体可在NIH3T3细胞表达。Western Blotting结果显示细胞培养上清有IP-10蛋白表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,为进一步研究其对Th1型自身免疫性疾病的治疗效果奠定基础.
- 赵玉杰林媛李明远李虹蒋忠华
- 关键词：干扰素-Γ真核表达自身免疫性疾病
- 铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定被引量：1
- 2007年
- 目的构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性。结果经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别。结论PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础。
- 张琴李明远张林蒋忠华祁志荣李虹
- 关键词：PE38KDEL原核表达
- 大鼠干扰素诱导蛋白-10真核表达质粒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达
- 2006年
- 目的构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)基因的真核表达质粒,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验所需的IP-10基因片段,通过酶切IP-10基因片段、真核表达质粒载体pEGFP-c1和连接反应,构建IP-10的真核表达质粒pEGFP-c1-IP-10,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测pEGFP-c1-IP-10在NIH 3T3细胞中的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因片段被成功克隆入真核表达质粒载体pEGFP-c1,免疫荧光技术检测证实,该基因能在NIH 3T3细胞中表达。结论证实IP-10基因可在NIH 3T3细胞中表达,为将其作为DNA疫苗治疗自身免疫性疾病的研究奠定了基础。
- 祁志荣李明远张林蒋忠华代吕霞李虹
- 关键词：NIH3T3细胞
- 大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10在大肠杆菌中的表达和鉴定被引量：4
- 2006年
- 目的原核表达大鼠γ干扰素诱导蛋白10,并对其进行鉴定。方法从大鼠脾细胞中提取RNA,用RTPCR方法得到IP10cDNA,双酶切将其插入pET32a(+)载体中。重组质粒pET32a(+)IP10经酶切、PCR及测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果所获得的大鼠IP10克隆,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDSPAGE和Westernblot分析获得证实。结论已成功构建原核表达载体pET32a(+)IP10,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。
- 代吕霞祁志荣李明远蒋中华张林李虹
- 关键词：克隆原核表达
- 大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达被引量：1
- 2007年
- 目的构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PRKL459K-IL-4-PE38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL。重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH3T3细胞的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH3T3细胞表达。结论rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础。
- 孙岚祁志荣张琴林媛李明远张林蒋忠华李虹
- 关键词：PE38KDEL重组免疫毒素NIH
- 免疫毒素IP10-DT390核酸制剂对实验性变态反应性脑脊髓炎的治疗作用
- 2007年
- 研究重组免疫毒素杀伤活化T细胞后,对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的发生和发展产生的抑制作用。利用含有编码重组免疫毒素IP10-DT390的真核质粒,直接导入动物肌肉,使IP10-DT390在骨骼肌内表达,通过IP10-DT390对活化T细胞的选择性杀伤,探索对EAE的治疗效果。实验结果显示,这种新型免疫毒素核酸制剂可以减轻EAE模型鼠的发病症状、选择性的减少中枢系统自身活化的T淋巴细胞浸润、降低外周血T细胞数量,而对免疫反应的其他成分影响不明显。该免疫毒素核酸制剂可能成为治疗有关自身免疫性疾病的一种新的有效方法。
- 陈文捷李虹贾怡李明远蒋中华吕梅励张林
- 关键词：IP10DT390重组免疫毒素T细胞
- 大鼠IP-10-PE38KDEL重组免疫毒素原核表达载体的构建及表达被引量：1
- 2008年
- 目的构建大鼠γ干扰素诱导蛋白10(IP-10)基因和绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因的原核融合表达载体,并对其表达进行鉴定。方法通过PCR获得本实验所需要的IP-10基因片段,通过酶切含有PE38KDEL的质粒PRKL459K获得绿脓杆菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建IP-10与PE38KDEL融合基因的原核表达载体pET-32a(+)-IP-10-PE38KDEL,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western-blotting分析证实其相对分子质量和特异性。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆入原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌中稳定表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符,且所表达蛋白可被抗PE的特异性抗体识别。结论成功构建了原核表达载体pET-32a(+)-IP-10-PE38KDEL,其融合基因在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其功能奠定了基础。
- 林媛祁志荣孙岚李明远蒋忠华张林李虹
- 关键词：IP-10绿脓杆菌外毒素重组免疫毒素原核表达
- γ-干扰素诱导蛋白-10融合蛋白的表达纯化及其生物学活性测定被引量：2
- 2009年
- 目的表达大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10(IP-10)融合蛋白,并测定其生物学活性。方法从大鼠脾细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法得到IP-10cDNA,双酶切将其插入pET-32(a)+载体中。重组质粒pET-32a(+)-IP10经测序证实。将pET-32a(+)-IP10转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,目的蛋白经镍离子亲和层析柱纯化。微室跨膜迁移实验测定其生物学活性。结果测序表明,所构建的重组质粒pET-32a(+)-IP10序列完全正确,诱导表达的蛋白的相对分子量同预期分子量相同,微室跨膜迁移实验测定出IP-10融合蛋白对激活的T淋巴细胞具有良好的趋化活性。结论成功在大肠杆菌中表达了IP-10融合蛋白,并具有生物学活性。
- 代吕霞李明远蒋中华张林李虹
- 关键词：融合蛋白生物学活性
