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四川省重点科学建设项目(SZD0418): 作品数：136 被引量：868H指数：17; 相关作者：程安春汪铭书陈孝跃周毅贾仁勇更多>>; 相关机构：四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室西南民族大学更多>>; 发文基金：四川省重点科学建设项目教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家科技攻关计划更多>>; 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>

利用16S rDNA序列对两种芽孢杆菌的鉴定被引量：14: 2009年; 根据不同种属细菌的16 S rDNA序列两端的保守性区域设计通用引物,提取菌株的基因组DNA,对菌株的16 S rDNA进行了PCR扩增,对扩增到的目标片段进行了测序,将测序结果与NCBI上已知菌种的16 S rDNA序列进行了BLAST对比,并构建了系统进化树。结合传统的形态观察及生理生化特性鉴定,16 S rDNA序列分析结果证实芽孢杆菌Pab02为枯草芽孢杆菌,PAS38为蜡样芽孢杆菌。; 潘康成冯兴崔恒敏张亚兰; 关键词：蜡样芽孢杆菌 RDNA 系统发育分析

鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析被引量：4: 2008年; 根据笔者实验室新发现的鸭瘟病毒(DPV)dUTPase基因(GenBank登录号DQ486149)序列设计1对引物,PCR扩增后将产物亚克隆至pET32a(+)原核表达载体,获得表达质粒pET32a-DU。然后将其转化至E.coliBL21(DE3)进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约66.8 ku,与预期表达蛋白大小一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的36.2%,主要以包涵体的形式存在。重组蛋白纯化后制备兔抗血清,间接ELISA效价为1∶409 600。通过免疫荧光技术进行DPV dUTPase亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4 h的胞质中检测到特异性荧光,12 h大量点状绿色荧光聚集于胞核;24 h后胞核内点状荧光减弱,而胞质点状荧光增强;48 h胞核和胞质荧光均显著减弱。本研究为DPV dUTPase基因功能和DPV致病机理的研究提供了重要数据。; 招丽婵程安春汪铭书袁桂萍贾仁勇周登春葛菡孙涛陈孝跃; 关键词：鸭瘟病毒克隆亚细胞定位

麻鸭α干扰素基因的克隆与序列分析被引量：10: 2006年; 根据G enB ank文献,应用O ligo 6.0分析软件设计合成了用于扩增鸭Ⅰ型干扰素(-αIFN)基因的2对引物,以麻鸭肝脏提取的基因组DNA为模板,采用N est-PCR方法扩增获得了约600 bp片段,经T载体克隆和测序分析证实,是麻鸭Ⅰ型干扰素基因(SD IFN-α)。生物信息学分析表明,SD IFN-α的开放阅读框架(ORF)由576个核苷酸所组成,预测蛋白质相对分子质量为21 640,编码191个氨基酸,其中前28个氨基酸可能是信号肽部分,切割位点在28号氨基酸A和29号氨基酸S之间,序列中无内含子。成熟的多肽中含8个半胱氨酸和2个糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点(prote in k inase C phosphory lation s ite)和2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(case in k inaseⅡphosphory lation s ite)。SD IFN-α与鸭α-IFN基因核苷酸同源性为99.3%,有4个碱基的差异;与北京鸭α-IFN基因的核苷酸同源性为99.1%,氨基酸同源性为98.96%;与鸡-αIFN的核苷酸同源性为71.8%。与鹅、狗、牛、马和人的-αIFN基因的核苷酸同源性分别为96.0%、45.8%、45.5%、44.6%和41.7%。遗传进化分析结果表明,IFN-α的这些同源性与其动物分类地位相一致。; 陈斌程安春汪铭书余勇唐琼石谦张东彭健康陈海滨; 关键词：麻鸭克隆

鸭IFN-α真核表达质粒基因枪免疫对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭细胞免疫调节作用初探被引量：3: 2007年; 为探索鸭α干扰素(IFN-α)真核表达质粒(pcDNA-SDIFN-α)对鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭的细胞免疫调节作用,本研究将pcDNA-SDIFN-α以1、3和6μg/只3个剂量用基因枪轰击法分别免疫28日龄鸭,以PBS和空载体质粒pcDNA3.1(+)为对照,所有鸭15 d后接种鸭瘟(DP)弱毒疫苗。接种后第3、7、14、21、28、35、49、63、84天采血用淋巴细胞增殖试验(MTT法)测定鸭外周血中T淋巴细胞转化效果;第7、14、21、28、35、49天采血用流式细胞仪(FACS)测定CD3+T淋巴细胞数量的动态变化。结果发现:①T淋巴细胞对ConA的反应能力(OD值),不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭外周血T淋巴细胞转化功能于第3-84天均高于PBS和空载体pcDNA对照组,其中第3-84天1μg/只组极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天极显著(P≤0.01)或显著(P≤0.05)高于PBS和pcDNA对照组;1μg/只组第3-35天显著(P≤0.05)高于3、6μg/只组;3μg/只组于第14-35天高于6μg/只组,但差异不显著(P≥0.05);pcDNA对照组略高于PBS对照组,但差异不显著(P≥0.05);②CD3+T淋巴细胞数量变化,不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组鸭于第7-49天均高于PBS和pcDNA对照组,其中1μg/只组于第14-49天极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组,3μg/只组于第21-49天极显著(P≤0.01)高于PBS对照组和显著(P≤0.05)高于pcDNA对照组,6μg/只组于第7-49天显著(P≤0.05)或极显著(P≤0.01)高于PBS和pcDNA对照组;1、3和6μg/只组之间差异不显著(P≥0.05);pcDNA组于第14-49天高于PBS组,但差异不显著(P≥0.05)。研究表明,pcDNA-SDIFN-α提前15 d免疫能显著增强DP弱毒疫苗诱导的鸭细胞免疫力,以基因枪免疫1μg/只的效果最佳,它是一种良好的增强DP弱毒疫苗细胞免疫的分子佐剂。; 程志萍程安春汪铭书陈斌刘闯段坤周雪陈孝跃; 关键词：基因枪鸭瘟弱毒疫苗细胞免疫分子佐剂

原位杂交在病原微生物检测中的应用被引量：1: 2010年; 原位杂交技术是分子遗传学与细胞遗传学相结合而产生的一门新兴技术,具有很高的敏感性和特异性,在当今细胞生物学、分子生物学研究中有着广泛的应用。文章对原位杂交的产生和发展、基本方法和特点及其在病原微生物检测方面的研究进展进行了阐述。; 娄昆鹏程安春汪铭书; 关键词：原位杂交病原微生物

沙门菌外膜蛋白的免疫学研究进展: 2008年; 张振华程安春汪铭书; 关键词：免疫学技术外膜蛋白沙门菌机体免疫系统基因检测 OMP

鸭瘟病毒强毒株在感染鸭实质器官内的增殖与分布被引量：9: 2008年; 鸭瘟病毒(DPV)CHv强毒株经皮下注射、滴鼻和口服3种途径分别感染20日龄天府肉鸭,于攻毒后10、30、60、90min以及4、12、48、72h和9、15d每组分别剖杀2只鸭,采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊、哈德氏腺等实质器官,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV在这些器官的分布和增殖进行检测。结果表明,DPV分布到具体器官的速度与感染的途径、鸭的解剖结构密切相关,其中皮下注射是DPV分布到各实质器官速度最快的途径。30min于皮下感染鸭的肝、脾、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、肺、脑、肾,口服感染鸭的肺和法氏囊,滴鼻感染鸭的心脏和哈德氏腺均检测到DPV-DNA;90min所有受检样品中检测到DPV-DNA。鸭抗DPV感染的免疫器官的重要性依次是脾、胸腺、法氏囊和哈德氏腺,30min内DPV-DNA分布到脾、胸腺、法氏囊的速度和数量决定了DPV感染的潜伏期和疾病的严重程度。不同途经感染鸭的相同器官在同一时间内的DPV-DNA拷贝数大多以皮下感染鸭为最高。DPV致死鸭的法氏囊和肾是DPV-DNA含量最高的实质器官。; 杨晓燕程安春汪铭书齐雪峰郭宇飞葛忠源黄永成张素辉胡骑于波周登春陈孝跃; 关键词：实时荧光定量PCR

间接免疫荧光检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒及抗原定位方法的初步建立被引量：8: 2008年; 【目的】建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDVIgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为:切片在0.01mol·L-1柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修复20min后,以10%马血清37℃下封闭30min,然后加入1﹕50的一抗4℃孵育过夜,最后加入1﹕100FITC标记的含0.01%伊文斯蓝的二抗37℃孵育30min。IFA检测DSHDV感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阳性,而检测鸭瘟、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏石蜡切片为阴性。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官,心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性;哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃为阴性。阳性组织中病毒抗原主要分布在细胞浆。经甲醛固定保持1～6年的临床死亡鸭的病毒分离阳性肝脏,IFA检测结果也呈阳性。DSHDV具有呼肠孤病毒特征,有10条分节段核酸,呈"334"分布。【结论】建立的检测石蜡组织切片中DSHDV抗原的IFA具有直观、特异性强的优点,应用于DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果,可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。DSHDV抗原存在感染细胞浆,肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。; 张舍郁程安春汪铭书沈婵娟李传峰; 关键词：间接免疫荧光抗原定位

疱疹病毒TK基因的研究进展被引量：10: 2008年; 简述了疱疹病毒具有表达外源基因的优势,介绍了TK基因作为疱疹病毒化学治疗和构建疱疹病毒基因缺失疫苗的首选靶基因。从TK基因的特点、TK基因的表达调控、TK酶生化特性、TK的功能域等方面做了综合论述,并对其今后的研究和应用前景进行了讨论。; 葛菡程安春汪铭书朱德康罗启慧贾仁勇郭宇飞陈孝跃; 关键词：疱疹病毒胸苷激酶基因生化特性功能域

鸭病毒性肠炎病毒强毒株的形态发生学与超微病理学研究被引量：26: 2004年; 应用透射电镜和超薄切片技术,研究鸭病毒性肠炎病毒(duckenteritisvirus,DEV)CH强毒株人工感染成年鸭后,病毒在宿主细胞内的形态发生及各组织器官的超微结构变化。结果表明,感染后不同时间剖杀及发病后死亡鸭的肝、肠、脾、胸腺、法氏囊等组织器官中,均观察到典型的疱疹病毒粒子。病毒主要的靶细胞为淋巴细胞、网状内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、肠道上皮细胞、肠道平滑肌细胞和肝细胞等。DEV的核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型四种形态,存在胞核和胞浆两种装配方式。病毒核衣壳可在核内获得皮层,通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒;也可通过内外核膜进入胞浆,在其中获得皮层,然后在各种质膜上获得囊膜,最后成熟病毒释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密病毒核酸颗粒、微管和中空短管以及胞浆内膜包裹的电子致密小体、双层管等病毒相关结构。超微研究表明,组织细胞有坏死和凋亡两种变化。坏死细胞肿胀甚至破裂,线粒体肿胀空泡化,粗面内质网扩张,核糖体脱落,有的细胞器甚至完全崩解,染色质或固缩或溶解。凋亡细胞则染色质聚集,胞浆凝聚深染,细胞膜上有大量空泡,并有凋亡小体形成。细胞坏死与凋亡往往同时存在,疾病发?; 袁桂萍程安春汪铭书周毅刘菲韩晓英廖永洪徐超郭宇飞周伟光文明贾仁勇陈孝跃; 关键词：鸭病毒囊膜强毒株核衣壳法氏囊

四川省重点科学建设项目(SZD0418)

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