浙江省自然科学基金(302769)
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
- 相关作者：吕建新彭颖潘建华瞿佳周翔天更多>>
- 相关机构：温州医学院更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金浙江省教育厅科研计划浙江省医药卫生重点科技项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组人EGF-IL-18融合蛋白的表达纯化及复性被引量：4
- 2006年
- 融合基因EGF-IL-18与表达载体pET32a(+)连接构建融合型原核表达质粒pET32a(+)-EGF-IL-18。该基因在E.coliRosetta(DE3)中获得高效表达,SDS-PAGE分析表明表达产物大部分以包涵体形式存在。以2mol/L尿素和1%TritonX-100对包涵体进行反复洗涤后,利用离子交换柱层析对包涵体进行柱上复性,结果表明离子交换层析柱上复性不仅能够获得可溶性的EGF-IL-18融合蛋白,而且产物同时得到纯化,纯度大于90%。复性的EGF-IL-18经分子筛进一步纯化后,体外实验证明具有促进人外周血单个核细胞(PBMC)IFN-g基因表达的能力。该方法简单、高效,为进一步开展EGF-IL-18的动物实验及其大量纯化制备打下基础。
- 潘建华彭颖郑昭暻吕建新
- 关键词：包涵体
- 杆状病毒介导LacZ基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞(英文)
- 2003年
- 目的 :研究重组杆状病毒 (baculovirus)载体介导 β 半乳糖苷酶基因 (LacZ)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达情况。方法 :将质粒pCMV β中的CMV LacZ表达盒插入杆状病毒表达载体pFastBacI的EcoRI/HindⅢ位点 ,构建重组质粒pBac β ,并利用Bac to Bac表达系统在Sf9细胞中产生出重组杆状病毒BV β。将MOI为 2 0 0的BV β感染经酶消化加显微法分离培养的IPE细胞 ,2 4h后进行X gal染色。在显微镜下观察IPE中LacZ表达阳性的情况 ,记录阳性细胞所占的百分比。结果 :限制性酶切分析及测序结果表明 ,我们已成功构建表达质粒pBac β及重组杆状病毒BV β。X gal染色证实杆状病毒介导LacZ在细胞中的表达呈蓝色 ,弥漫于整个胞浆。感染后 2 4h时表达阳性率达 85 %。结论 :重组杆状病毒可有效介导报告基因在体外培养的IPE细胞中表达 ,为利用杆状病毒构建可供移植的基因工程化虹膜色素上皮细胞提供了实验依据。
- 彭颖周翔天付小莹吕建新瞿佳
- 关键词：杆状病毒LACZΒ-半乳糖苷酶基因
- 应用实时荧光定量PCR测定AdEasy系统中重组腺病毒滴度(英文)被引量：3
- 2004年
- 目的 :确立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法 ,对AdEasy系统中的重组腺病毒滴度进行测定。方法 :采用Stratagene公司的AdEasyTM载体系统在 2 93细胞中构建重组腺病毒 ,经 10倍梯度稀释的病毒母液用以提取基因组DNA及空斑测定。以 10倍梯度稀释的pAdEasy质粒作为标准模板进行实时PCR反应扩增六邻体基因片段 ,并绘制标准曲线。然后以上述的重组腺病毒DNA为模板 ,采用同样体系进行实时PCR反应 ,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度。结果 :成功构建了重组腺病毒并对其进行了空斑测定。运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线性范围为 10 1～ 10 8拷贝。病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/ml)值 ,约为空斑滴度 (pfu/ml)值的 10倍。结论 :荧光实时定量PCR方法可在较大的线性范围内检测重组腺病毒滴度 ,较之空斑法更为准确地反映了重组腺病毒的实际数量。
- 彭颖吕建新祝武强
- 关键词：腺病毒载体实时定量PCR病毒滴度
