国家科技重大专项(2002AA2Z3451)
- 作品数：17 被引量：73H指数：5
- 相关作者：储炬张嗣良庄英萍刘建宁丁满生更多>>
- 相关机构：华东理工大学南京大学上海凯曼生物科技有限公司更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 温度对巴斯德毕赤酵母表达瑞替普酶(reteplase)的影响被引量：9
- 2007年
- 研究了温度对巴斯德毕赤酵母表达瑞替普酶(reteplase,rPA)的影响。结果发现,在BMMY摇瓶培养条件下,诱导温度在20℃、25℃,rPA表达量较高,分别是30℃诱导条件下(18.2mg/L)的1.4倍和1.34倍。在高密度发酵过程中,降低诱导温度(20℃、25℃),rPA的表达量在诱导表达84h时达到最高,分别为207.9mg/L和199.5mg/L,比30℃诱导条件下分别提高了35%和30%。通过对细胞活性、蛋白酶和AOX酶活性分析发现,降低温度不仅提高了发酵过程中酵母活细胞率,降低了蛋白酶的活性,减少了rPA的降解,而且提高了AOX酶活,增强了rPA的表达。
- 方曙光储炬黄立庄英萍张嗣良
- 关键词：毕赤酵母RETEPLASE降解温度
- 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定被引量：3
- 2004年
- 利用RT PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2.1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a/K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌.经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20%.该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性.
- 陈于红朱镇华刘蓓钫张菁傅一工王石泉张巍杨庆刘建宁
- 关键词：工程菌质粒稳定性克隆
- 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究被引量：2
- 2004年
- 将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95%以上,比活大于500000IU/mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准.其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符.同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究.
- 朱镇华孙自勇陈于红张菁王石泉杨庆刘莉莉丁楅森陈新园刘建宁
- 关键词：发酵活化纯化蛋白
- Mn^(2+)对必特螺旋霉素产生菌代谢和必特螺旋霉素合成的影响被引量：17
- 2005年
- 通过在必特螺旋霉素产生菌WSJ 1 195发酵过程中添加金属离子Mn2 + 发现 :发酵前期 (2 4h左右 )添加Mn2 + 可以明显提高生物效价 ,加入的Mn2 + 浓度以 5mmol L为最佳。实验显示添加Mn2 + 后发酵液pH逐渐下降 ,整个产素期间pH一直低于对照 ;与对照相比添加Mn2 + 摇瓶菌体浓度也较低。通过研究必特螺旋霉素发酵过程有机酸的变化趋势发现 :2 4h添加 5mmol LMn2 + 后发酵过程中有机酸含量已经发生变化 ,其中丙酸浓度的增长最为显著 ,84h时其浓度为对照的 6倍。通过丙酸盐的添加实验证实了发酵前期添加Mn2 + 可以促进产物合成的原因之一是促进了丙酸等前体酸的合成 。
- 康源王永红庄英萍储炬张嗣良
- 关键词：锰离子必特螺旋霉素代谢生物合成大环内酯类抗生素
- 重组人载脂蛋白A-I_((米兰变体))的复性及纯化
- 2004年
- 目的 从大肠杆菌中获得载脂蛋白A I(米兰变体 ) 的包涵体 ,对包涵体进行复性、纯化 ,最终获得具有生物活性的载脂蛋白A I(米兰变体 ) 。方法 包涵体以尿素溶解后 ,以疏水层析法复性重组蛋白 ;以离子交换层析对其进一步纯化 ,并对所得的蛋白进行生物活性分析。结果 经复性纯化的蛋白纯度达 95 % ,体外生物活性检测显示其具有生物活性。结论 本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化 。
- 汪利俊丁满生郭美锦储炬庄英萍张嗣良谭小钉刘大涛
- 关键词：大肠杆菌载脂蛋白复性纯化包涵体
- 流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性被引量：1
- 2006年
- 建立了流式细胞仪检测重组巴斯德毕赤酵母(P.p astoris)细胞活性的方法,并在高密度发酵过程中得到应用。使用碘化丙锭染色法测定细胞活性,发现甲醇诱导时酵母细胞活性开始下降,随着细胞密度的增加,由于细胞胁迫和甲醇的影响,细胞活性明显下降,活细胞率最大下降了14%。与此同时,细胞生长减缓,目的蛋白发生降解,表明细胞活性与发酵过程中细胞的生长和目的蛋白生成等参数密切相关。实验证明:流式细胞仪可作为检测毕赤酵母发酵过程中细胞活性参数的一个便捷精确的有力工具。
- 方曙光黄立储炬庄英萍张嗣良
- 关键词：流式细胞仪毕赤酵母高密度发酵
- 重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究
- 2004年
- 犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用.
- 赵专友刘厚孝张菁陈于红张巍朱镇华王石泉刘建宁
- 关键词：药效学溶栓纤维蛋白原血小板聚集心脑血管病
- 重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定被引量：7
- 2004年
- 人脑钠素(hBNP，human brain natriuretic peptide)是心室分泌的由32个氨基酸组成的多肽激素．临床研究表明，hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物．化学合成脑钠素全基因，以pET32a为表达载体，构建了硫氧还蛋白-脑钠素(thioredoxin—hBNP)融合蛋白表达质粒，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，融合蛋白的表达量占全菌蛋白量的25％以上．融合蛋白经肠激酶裂解、Zn—Sepharose亲和层析和C4反相高效液相层析，从每升培养液中可获取4mg rhBNP，纯度达到95％．经质谱测定，rhBNP样品的分子量为3464Da．体外活性测定结果表明，rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应，其ED50为(2．24±0．58)×10^-6mg／mL．
- 孙自勇朱镇华陈均勇刘莉莉张巍杨庆张菁刘建宁
- 关键词：大肠杆菌纯化肠激酶酶解多肽激素
- 牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定被引量：12
- 2004年
- 用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.
- 孙自勇陈均勇陈新园汪晶田鹏鹏吴盛刘建宁
- 关键词：肠激酶毕赤酵母分泌表达纯化免疫印迹
- 重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化被引量：1
- 2004年
- 将化学合成的rhPTH(1 34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET＿35b(+),使rhPTH(1 34)融合于纤维素结合结构域(CBDclos)的羧基端,并得到高效表达.融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经FactorXa裂解释放出rhPTH(1 34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1 34)纯品.每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1 34).经质谱测定,所得样品的分子量为4117.0Da,与rhPTH(1 34)理论分子量一致.
- 陈均勇陈新园孙自勇刘莉莉朱镇华汪晶吴盛王石泉刘建宁
- 关键词：甲状旁腺激素大肠杆菌纯化FACTOR
