广东省科技攻关计划(200521-E4023)
- 作品数：1 被引量：1H指数：1
- 相关作者：刘耘曹以诚李刚刚更多>>
- 相关机构：华南理工大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 高纯度质粒DNA规模化生产流程的建立和改进被引量：1
- 2008年
- 通过对质粒提取过程进行分析,探讨质粒提取过程中的影响因素,分析影响质粒质量的因素,以及优化提取工艺流程,并建立质控标准来控制质粒提取过程中带来质量和数量损失,从而制备出高纯度的质粒DNA。温度诱导可以增加质粒DNA的产量,在大肠杆菌对数生长中期进行温度诱导,从37～43℃,每间隔1℃度进行诱导,结果表明经42℃诱导12h,质粒DNA的产量可以增加66%以上,为降低成本,大规模生产重组质粒提供良好保障。另外对碱裂解粗提质粒的方法和流程进行改进,采取LiCl去除细胞碎片和杂蛋白;PEG8000沉淀质粒DNA从而去除经RNAase消化的RNA;之后利用少量的酚氯仿混合液去除蛋白质;不仅蛋白质,RNA去除干净,而且在实验时间安排上以及试剂使用量上进行控制,达到了贵重试剂使用量少,去除杂质干净的效果,更为后续的精提做好准备。利用凝胶层析,亲和层析,阴离子交换层析依次去除残余在质粒DNA中的蛋白质、RNA、非超螺旋DNA以及内毒素,达到了制备高纯度质粒DNA要求,并且达到了可以在动物实验中进行转染的质量要求。
- 李刚刚刘耘曹以诚
- 关键词：纯化
