江南大学生物工程学院工业微生物与生物反应工程研究中心
- 作品数：33 被引量：216H指数：6
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- 固定化Amycolatopsis sp.ST2710分段发酵无锡他汀被引量：1
- 2012年
- 用海藻酸钠对Amycolatopsis sp.ST2710细胞进行固定化处理。以固定化细胞的机械强度以及分段发酵无锡他汀的转化率为指标,考察了海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、固定化时间和包埋菌体量对固定化细胞分段发酵无锡他汀的影响,得到最佳的固定化条件为:海藻酸钠浓度20 g/L、CaCl2浓度10 g/L、固定化时间1 h、包埋菌体量2 mL菌悬液/10 mL凝胶。对固定化细胞分段发酵无锡他汀的特点进行了研究,结果显示:Amycolatopsissp.ST2710经过固定化处理后,大幅度提升了其对底物洛伐他汀的耐受性,显著降低了对发酵培养基中的淀粉需求量,可重复利用。当发酵两阶段pH分别为7.5和5.5、发酵时间分别为48 h和10 h、洛伐他汀添加量3 g/L、转化培养基中淀粉浓度15 g/L时,中间产物Ⅰ对洛伐他汀转化率为64%,无锡他汀对中间产物Ⅰ的转化率为75%。连续发酵5批后,产物转化率仍能维持较高的水平。
- 曹艳辉方慧英诸葛斌张锡红诸葛健
- 关键词：AMYCOLATOPSIS转化率
- 大肠杆菌aroG基因的定点突变及与trpBA基因的串联表达被引量：4
- 2013年
- 为了提高大肠杆菌生产色氨酸的产量,以大肠杆菌中aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS)与trpBA基因编码的色氨酸合成酶(TSase)两个关键酶为研究对象,利用SOE-PCR方法对aroG基因进行632位碱基定点突变,获得抗反馈抑制的定点突变aroGf br基因,并与扩增获得trpBA基因串联于pEtac表达载体上共表达,获得重组菌Escherichia coli JM109/pEtac-aroGfbr-tac-trpBA,同时构建对照菌株E.coli JM109/pEtac-aroG-tac-trpBA.两种串联表达质粒重组菌的DAHPS酶活性,分别比含空载体出发菌株相应酶的活性提高4.3倍和3.8倍,突变DAHPS酶活提高1.13倍.摇瓶发酵表明,所构建的两菌株与出发菌株色氨酸产量相比较,分别提高8.23倍和11.47倍,带突变aroGf br基因的菌株比对照菌株色氨酸产量提高1.4倍,色氨酸产量明显提高,说明突变菌株能有效解除苯丙氨酸的反馈抑制作用.
- 郝大利诸葛斌方慧英张成宗红诸葛健
- 关键词：色氨酸大肠杆菌基因定点突变
- 利用PDOR同工酶基因yqhD对产1,3-丙二醇克雷伯氏杆菌进行基因工程改造被引量：2
- 2008年
- 由于Klebsiella pneumoniae1,3-丙二醇合成途径中,加强甘油脱水酶基因表达,导致因NADH供应不足使3-羟基丙醛累积,并对菌体生长及1,3-丙二醇合成造成负面影响。为改善Klebsiella pneumoniae1,3-丙二醇合成途径,利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出以NADPH为辅酶的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,从克雷伯氏杆菌中扩增出2.66kb的甘油脱水酶基因(dhaB),构建了产1,3-丙二醇关键酶基因的串联载体pEtac-dhaB-tac-yqhD,并将其转入到野生克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)中,重组载体得到了表达。通过初步发酵,重组后的克雷伯氏杆菌产量比原始菌高20%左右,副产物中乙酸和丁二醇分别下降30%左右。
- 诸葛斌王勇方慧英毛忠贵诸葛健
- 关键词：3-丙二醇甘油脱水酶
- 牡丹花蕾提取物对铜绿假单胞菌的抑菌活性及其机理被引量：9
- 2019年
- 以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为试验菌,探究牡丹花蕾提取物的抑菌活性及机理。利用琼脂滤纸片扩散法和微量稀释法评价抑菌活性;测定生长曲线、膜脂肪酸组成、膜蛋白荧光光谱、膜通透性及细胞形态变化来探究抑菌机理。牡丹花蕾提取物抑制铜绿假单胞菌生长,最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀死浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)分别为3.13和6.25 mg/mL。在MIC和MBC下,细胞膜饱和脂肪酸相对含量提高了6.06%和8.19%,而单不饱和脂肪酸相对含量降低了5.17%和6.91%,从而导致膜流动性降低;同时提取物降低膜蛋白Phe、Trp和Tyr荧光强度,表明膜蛋白构象改变,导致膜功能产生障碍。此外,提取物破坏膜完整性和增加膜通透性。牡丹花蕾提取物通过改变膜脂肪酸组成和膜蛋白构象并破坏膜完整性发挥抑菌作用,可作为防腐保鲜剂予以开发。
- 周云冬章漪玲宗红宗红诸葛斌陆信曜
- 关键词：铜绿假单胞菌抑菌活性抑菌机理细胞膜损伤
- 甘油脱水酶再激活因子提高重组大肠杆菌3-羟基丙酸合成能力被引量：6
- 2011年
- 甘油脱水酶是甘油转化3-羟基丙酸生物合成途径中的关键性限速酶,然而底物甘油的存在会抑制该酶的活性,从而引起3-羟基丙酸合成量的下降。因此解除底物甘油对甘油脱水酶活性的抑制作用,是提高生物合成3-羟基丙酸产量的方法之一。克隆来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶编码基因dhaB、甘油脱水酶再激活因子编码基因gdrA、gdrB,以及来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeW303)的乙醛脱氢酶编码基因aldH,分别构建了基因工程菌Escherichia coliJM109/pEtac-dhaB-tac-aldH和E.coliJM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH,考察甘油脱水酶再激活因子对3-羟基丙酸生物合成的影响。在好氧条件下发酵28小时,E.coliJM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH与E.coliJM109/pEtac-dhaB-tac-aldH3-羟基丙酸合成量分别为4.0 g/L和0.54 g/L,前者与后者相比,3-羟基丙酸合成量提高了6.4倍。研究结果表明,甘油脱水酶再激活因子能有效激活甘油脱水酶的活性从而提高了目标产物3-羟基丙酸的生物合成量。
- 权国燕方慧英诸葛斌张波姚佳佳诸葛健
- 关键词：甘油重组大肠杆菌3-羟基丙酸甘油脱水酶
- 产甘油假丝酵母甘油合成关键酶编码基因的克隆被引量：4
- 2008年
- 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)作为优良的甘油生产菌株已经成功应用于工业化生产。但相对于酿酒酵母,该菌株的耐高渗机理和甘油代谢的分子机制还不甚清楚。本文根据已公布的3-磷酸甘油脱氢酶基因的序列信息,设计出一组寡核苷酸,再运用简并PCR结合反向PCR技术从C.glycerinogenes的基因组DNA中获得了4900 bp的核苷酸序列,递交GenBank(No.EU186536)。该序列包含完整的编码胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD)开放阅读框及其上、下游调控序列。1167bp的开放阅读框编码388个氨基酸残基的蛋白。所演绎出氨基酸序列分析比对结果表明该基因产物的序列具有典型的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶结构特征,但与已鉴定的相关基因存在中等程度的同源性并在相应的辅酶催化位点和底物结合位点区域具有高度的保守性,在氨基酸水平上与安格斯毕赤酵母的相似性最高,达到70.9%。该基因在Saccharomy cescerevisiae W303A中异源表达能够显著提高细胞的甘油合成能力。
- 陈献忠方慧英沈微饶志明诸葛斌王正祥诸葛健
- 关键词：产甘油假丝酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆甘油合成
- 一种快速提取真菌染色体DNA的方法被引量：112
- 2004年
- 介绍了一种适用于多种真菌染色体DNA的快速提取方法。该方法用石英砂振荡破壁 ,快速便捷地提取真菌染色体DNA ,提取时间仅用 1～ 2h。作者应用该方法成功地提取了粗糙脉胞菌 (Neurosporacrassa)、米曲霉 (Aspergillusoryzae)、羊肚菌 (Morchellaesculcnta)、酿酒酵母 (Saccharomycescervisae)等 4种不同真菌的染色体DNA ,所提DNA片段均大于2 0kb ,可直接用于限制性内切酶酶切。
- 周小玲沈微饶志明王正祥诸葛健
- 关键词：真菌染色体DNA
- 构建丝状真菌大片段基因组文库载体DNA的制备
- 2004年
- 载体DNA的制备是构建大片段基因组文库的关键步骤之一。高质量载体DNA受到酶切、脱磷等因素的影响。以载体pBHYG为材料 ,优化了限制性内切酶HindIII酶切和小牛肠碱性磷酸酶 (CIAP)脱磷的作用条件 ,并在T4连接酶作用下自连 ,通过胶回收纯化制备了可用于进一步构建大片段基因组文库的线性载体DNA。
- 周礼红诸葛健
- 关键词：酶切脱磷
- 有效利用木糖的肠道细菌的筛选及转化被引量：2
- 2003年
- 以木糖为惟一碳源筛选得到了 32株能利用木糖快速生长的肠道细菌 ,初步鉴定结果表明 ,有效利用木糖的菌株多为肺炎克雷伯氏杆菌 ,其次是大肠杆菌 .选择合适的质粒对其中的 94 7菌株、15 6 9菌株及E .coliJM 10 9进行转化 ,检验转化子中的质粒在无选择压力条件下的传代稳定性 ,结果野生型菌株的转化率均明显低于E .coliJM 10 9,质粒 pET 2 8a在所试验的几株菌中稳定性相对较差 ,pKK2 2 3 3能在 94 7菌株中稳定存在 .
- 孙金凤诸葛健王正祥
- 关键词：木糖肠道细菌质粒稳定性酒精发酵生产
- 利用PCR-DGGE技术筛选分离海南黄帝椒产品微生物被引量：3
- 2012年
- 黄帝椒是海南特产高辣度辣椒。该研究以黄帝椒产品为原料,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析了其微生物种群关系,并结合传统平板筛选法进行菌种分离及鉴定,获得了海南特辣黄帝椒产品优势微生物。研究结果显示,海南黄帝椒产品平板筛选分离到了Pseudomonas stutzeri,Lactobacillus plantarum,Lactobacillus brevis等可培养的菌株;DGGE图谱中检测到了6个条带,其中,乳酸菌占总菌数的65%,处于最优势地位,假单胞菌占总菌数的16%,处于次要地位。该研究也首次提及了不同的微生物对黄帝椒产品的颜色、脆性的影响。
- 李汉文诸葛斌方慧英孙进龚星慧诸葛健
- 关键词：PCRDGGE微生物
