刘云
- 作品数：32 被引量：125H指数：7
- 供职机构：军事医学科学院放射与辐射医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金天津市科技攻关项目更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程医药卫生更多>>
- 人视黄醇结合蛋白基因的高效表达及其专用引物
- 本发明公开了一种人视黄醇结合蛋白的基因高效表达方式及其专用引物,其方式为:(1)从人肝组织中提取总RNA;(2)合成引物;(3)通过逆转录聚合酶链式反应得到人视黄醇结合蛋白基因片段;(4)将基因克隆入pET3a、pET2...
- 徐琪寿梁学颖黄英武刘云刘志红刘耀清
- 文献传递
- 苯丙氨酸生物合成的研究进展被引量：16
- 2002年
- 代谢工程是利用分子生物学原理系统分析代谢途径,设计合理的遗传修饰策略从而优化细胞的生物学特性。本文对代谢工程及其在氨基酸生产上的应用进行了简单的回顾,比较了苯丙氨酸的几种合成途径,重点综述了苯丙氨酸生物合成的代谢途径、相关酶及其调控方式、代谢流和转运系统的分析研究,并对苯丙氨酸生产策略的优化及未来发展进行了展望。
- 李永辉刘云徐琪寿
- 关键词：苯丙氨酸生物合成代谢工程
- 脱氢奎尼酸合成酶基因aroB在大肠杆菌中的克隆和表达被引量：3
- 2004年
- 目的 :克隆表达大肠杆菌脱氢奎尼酸合成酶基因aroB ,并测定其生物学活性。方法 :根据大肠杆菌中aroB基因的序列设计了一对引物 ,利用PCR技术扩增得到aroB基因 ,将其克隆入pGEM Teasy载体中 ,以双脱氧法进行测序 ,然后再克隆入高效原核表达载体pBV2 2 0 ,对该重组子的SD序列进行调节后利用温度诱导表达 ,并测酶的生物活性。结果 :构建了aroB基因的克隆和表达重组子 ,经SD序列调节后 ,aroB基因获得高效表达 ,SDS PAGE图谱显示新增 38.8× 10 3 蛋白带 ,酶活性测定结果表明脱氢奎尼酸合成酶的相对酶活性为 5 .4。结论 :实现了脱氢奎尼酸合成酶基因在大肠杆菌中的高效表达 ,为构建产脱氢奎尼酸工程菌种奠定了基础。
- 常会波刘云吴建新徐琪寿
- 关键词：大肠杆菌基因表达
- 生产氨基酸的基因工程菌研究进展被引量：7
- 1999年
- 随着抗癌药物制剂、氨基酸输液制剂及甜味二肽生产的飞速发展，对原料氨基酸的需求量日益增长。传统的发酵工业越来越不能满足需求，势必被以基因工程为基础的新兴发酵工业所代替。通过建立大肠杆菌及棒状杆菌的高效载体受体系统，运用ＤＮＡ重组、定向突变等手段，对代谢途径及关键酶进行了深入系统的研究，为代谢工程注入了新的活力，为获得高产。
- 刘云徐琪寿
- 关键词：氨基酸基因工程
- qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达被引量：21
- 2006年
- 奎尼酸脱氢酶的高表达是奎尼酸生物合成的代谢工程研究的关键和基础。粗糙脉孢菌基因组中编码奎尼酸脱氢酶的基因qa-3在大肠杆菌中不表达,根据大肠杆菌密码子使用频率分析qa-3基因,发现有27个稀有密码子,其中编码Arg(R)的有8个,编码Gly(G)的有9个。编码精氨酸的AGG(AGA)两个稀有密码子紧密相连(R区),另外还有个相对比较集中的GGG密集区G区。进一步通过计算机分析其qa-3基因mRNA二级结构,发现改变5′和3′末端个别碱基对其二级结构的影响很大,可以使mRNA的自由能由野生型的-374.3kJ/mol降低到最小-80.5kJ/mol,从而大大减少mRNA两端二级结构的产生,而仅仅改变R区和G区的稀有密码子自由能变化很小。通过对该基因密码子改造和优化5′和3′末端对其mRNA二级结构的影响,在大肠杆菌中表达真菌的基因qa-3,并测到了奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌株奠定基础。
- 刘礼兵刘云何华庆李永辉徐琪寿
- 关键词：密码子MRNA二级结构
- 视黄醇结合蛋白L35和Q98位点突变及其对与视黄醇结合的影响被引量：1
- 2002年
- 根据视黄醇结合蛋白 (RBP)晶体结构和计算机模拟对拟突变位点所作出的结构预测 ,筛选出 2个可能对RBP结合能力有影响的氨基酸位点 .利用定点突变技术分别将 35位亮氨酸突变为能引入较大构象变化的甘氨酸 ,将 98位谷氨酰胺突变为亲水、带正电的精氨酸 .将突变后的RBP基因转入表达宿主菌获得表达后 ,对突变体蛋白实现了变性条件下的分离纯化 .复性后与视黄醇的荧光增强饱和滴定试验表明 ,35位突变为甘氨酸后对RBP结合能力没有产生明显的影响 ,但 98位突变为精氨酸后 ,则显著的提高了与视黄醇的结合能力 ,说明 98位是影响RBP与视黄醇结合和解离的重要位点 .
- 王世春刘云胡远东张学清李松徐琪寿
- 关键词：视黄醇结合蛋白突变
- 大肠杆菌trpBA基因的克隆表达被引量：5
- 2006年
- 目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b(+)中,得到重组质粒pet22b(+)-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b(+)-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。
- 张绪梅郭长江刘云杨继军韦京豫徐琪寿
- 关键词：大肠杆菌克隆酶活性
- 大肠杆菌CM/PDT抗反馈抑制突变体的构建及其性质
- 2002年
- 为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶 预苯酸脱水酶 (chorismatemutase prephenatedehydrataseCM PDT) [EC5 .4 .99.5 EC4 .2 .1.5 1],通过相关菌种CM PDT氨基酸序列同源比较 ,寻找高度保守位点 .用定点突变及PCR法构建突变酶M1(缺失 30 4T、30 5G、Q30 6K)、M2 (缺失W 338)、M3(缺失 30 1～ 386位氨基酸 )、M32 9(E32 9A)和M374 (C374A) ,野生型及各突变型基因与pET2 8a(+ )载体连接后 ,表达融合蛋白 .在非变性条件下 ,由TALON金属螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白 .酶活性测定表明 ,突变体M3的PDT活性下降为野生型活性的 2 9% ,但保持了CM活性 .突变体M374保持了CM ,PDT两种酶的活性 ,突变体M1、M2、M32 9的CM ,PDT活性有一定程度的提高 .酶抗反馈抑制作用检测表明 ,突变体M3、M374解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ,M1、M2、M32 9部分解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 .与含野生型pheA基因的E .coliBL2 1菌株相比 ,含突变基因的E .coliBL2 1菌株对 10mmol L的苯丙氨酸代谢类似物具有强的抗反馈抑制作用 ,其中M1,M2 ,M3对 2 0mmol
- 刘云王世春张学清刘志红高波徐琪寿
- 人视黄醇结合蛋白基因的高效表达及其专用引物
- 本发明公开了一种人视黄醇结合蛋白的基因高效表达方式及其专用引物，其方法为：(1)从人肝组织中提取总RNA；(2)合成上游引物P1：5’TTTGAATTCATATGGAGCGCTACTGCCGAGTGAG3’；下游引物P2...
- 徐琪寿梁学颖黄英武刘云刘志红刘耀清
- 文献传递
- 代谢工程方法构建苯丙氨酸生物工程菌株
- 苯丙氨酸生物台成途径中的关键酶DAHP合成酶(DS)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(CM/PD)、氨基转移酶(AT),分别由基因aroG,pheA,TyrB编码.本研究通过代谢工程方法构建苯丙氨酸生物工程菌株.在基因序列同...
- 刘云张学清王世春徐琪寿马立人
- 文献传递
