尹昆
- 作品数：88 被引量：232H指数：8
- 供职机构：山东省寄生虫病防治研究所更多>>
- 发文基金：山东省自然科学基金国家自然科学基金山东省医药卫生科技发展计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学轻工技术与工程生物学更多>>
- pEGFP-N1-HBsAg-ROP2多基因重组表达质粒的构建及表达鉴定
- 2018年
- 目的构建p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2重组质粒,并转染HEK293T细胞进行表达鉴定,为弓形虫病核酸疫苗的研制奠定基础。方法根据HBs Ag基因序列和pc DNA3-p30-ROP2重组质粒酶切位点设计引物,PCR扩增HBs Ag基因,经酶切、连接、转化,利用HBs Ag基因替换p30基因,构建pc DNA3-HBs Ag-ROP2重组质粒;经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,将HBs Ag-ROP2片段与p EGFP-N1真核表达载体相连,构建p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞,观察其蛋白表达水平。结果 HBs Ag片段PCR产物约700 bp,与理论值相符;构建pc DNA3-HBs Ag-ROP2重组质粒,双酶切电泳后得到约5.4 kb和1.9 kb的两条带,与预期结果相符。p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2双酶切后产生约4.7 kb和1.9 kb的条带,经测序鉴定,与Gen Bank发表的序列同源性为99.84%。目的基因已成功转染入HEK293T细胞中,且正确表达,蛋白浓度为3.08 mg/ml。结论成功构建p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞能正确表达。
- 马荣肖婷李瑾孙慧徐超徐超尹昆尹昆赵桂华崔勇朱嵩刘功振魏庆宽
- 关键词：乙型肝炎PEGFP-N1质粒构建
- 弓形虫棒状体蛋白ROP16的研究进展
- 棒状体蛋白16(ROP16)是弓形虫棒状体蛋白家族成员,这类蛋白结构存在丝氨酸、苏氨酸激酶区,是弓形虫入侵过程中重要毒力因子.ROP16可分泌到宿主细胞核,能磷酸化宿主细胞的转录活化因子STAT,干扰宿主细胞信号通路传导...
- 刘功振崔勇李瑾魏庆宽黄炳成尹昆赵桂华徐超王洪法
- 关键词：弓形虫磷酸化
- N6-甲基腺嘌呤修饰在胃癌发生发展中作用的研究进展
- 2023年
- N6-甲基腺嘌呤修饰(N6-methyladenosine,m6A)是在真核细胞中最广泛的RNA修饰,属于表观遗传学修饰的一种,参与多种肿瘤的发生发展。胃癌是全球癌症死亡率排名第三的恶性肿瘤,目前对于胃癌的发生发展机制了解不完全,早期胃癌难发现,进展期胃癌手术机会少且药物治疗效果欠佳。而在胃癌中,m6A修饰相关因子表达异常,引发了m6A修饰失调,进而影响到胃癌的进展,这也提示我们m6A修饰相关因子有作为胃癌治疗靶点或诊断标志物的潜力。因此,本文就m6A修饰在胃癌发生发展过程中的作用以及可能涉及到的治疗方法予以综述。
- 徐昊志尹昆杨景玉
- 关键词：胃癌表观遗传学
- 弓形虫表面抗原IMP1的克隆原核表达及免疫学鉴定被引量：2
- 2015年
- 目的克隆刚地弓形虫强毒RH株的表面抗原免疫作图蛋白1(Immune mapped protein-1,IMP1),并对其进行原核表达纯化、鉴定。方法采用逆转录法合成刚地弓形虫RH株的第一链c DNA,以此为模板,用PCR法扩增野生型IMP1基因的最大开放阅读框(ORF)序列,TA克隆测序鉴定后,插入原核表达载体p ET28b中,构建重组表达载体p ET28bIMP1,经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达携带6×组氨酸标签的IMP1融合蛋白,改变温度、诱导时间和IPTG浓度以优化诱导表达条件并测定蛋白可溶性,通过镍离子螯合(Ni2+-NTA)亲和层析纯化IMP1融合蛋白,经Western blotting验证重组蛋白的特异性。结果在弓形虫RH株速殖子c DNA中成功调取了IMP1基因的ORF序列,并通过TA克隆和测序鉴定了IMP1基因的正确性,在此基础上构建了原核表达重组质粒p ET28b-IMP1,经双酶切和测序验证了重组载体的正确性,并通过条件筛选确定了IMP1的最佳表达条件为20℃下0.3 mmol/L IPTG诱导9 h。经镍柱亲和层析纯化后,IMP1全蛋白表达量和可溶性均较好,与镍柱填料有较高的亲和力,能实现高效纯化。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,IMP1具有良好的免疫活性。结论新型强毒弓形虫RH株的表面抗原IMP1可在大肠杆菌原核表达系统中高效表达,全长蛋白可溶,性状稳定。本研究为进一步制备IMP1多克隆抗体,进行后续的体内表达研究以及抗弓形虫感染亚单位疫苗的构建和IMP1晶体结构研究奠定了基础。
- 寇景轩赵桂华魏庆宽徐超朱嵩尹昆
- 关键词：弓形虫表面抗原原核表达
- 弓形虫TgMIC16的酵母表面展示
- 本研究利用酿酒酵母表面展示系统展示弓形虫微线蛋白TgMIC16,为下一步研制口服活载体疫苗奠定基础.参照GenBank 中对弓形虫微线蛋白TgMIC16 基因序列设计引物,以弓形虫RH 株RNA为模板,利用RT-PCR ...
- 孙慧魏庆宽李瑾尹昆肖婷徐超黄炳成
- 关键词：弓形虫酵母表面展示
- 弓形虫棒状体蛋白ROP38的原核表达与鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的原核表达弓形虫棒状体蛋白ROP38,并对重组蛋白rROP38的反应原性进行鉴定。方法根据已发表的ROP38基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP38基因。将ROP38部分基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并优化表达条件,SDS-PAGE分析表达情况,并通过Western blot鉴定其反应原性。结果 SDS-PAGE显示在上清和包涵体均有rROP38表达,分子量约为43k D。Western blot结果显示,rROP38蛋白能被His标签抗体和感染弓形虫的人阳性血清识别,说明ROP38具有良好的反应原性,可以作为潜在的血清学诊断抗原。结论本研究成功获得了具有良好反应原性的弓形虫重组蛋白rROP38。
- 崔勇李瑾王洪法仲维霞孙慧赵桂华尹昆徐超肖婷张晓玉于泓刘学峰刘功振
- 关键词：弓形虫原核表达
- 弓形虫ROP21基因的原核表达与免疫学鉴定被引量：9
- 2016年
- 目的原核表达弓形虫棒状体ROP21基因,并对rROP21蛋白进行免疫学鉴定。方法根据已发表的ROP21基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP21基因。将ROP21基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)后转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后进行SDS-PAGE分析、Western blot及IFA分析。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体。重组质粒转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,重组蛋白(rROP21)以包涵体形式高效表达,分子质量单位约为45ku。Western blot显示重组rROP21蛋白能被his标签抗体及弓形虫病患者血清识别。用rROP21免疫小鼠,获得滴度为1∶104的抗体血清。IFA显示弓形虫速殖子体内存在ROP21蛋白。结论构建的重组质粒pET28a-ROP21表达的弓形虫rROP21具有抗性,可作为血清学诊断候选抗原,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 李瑾孙慧崔勇王洪法刘学峰于泓赵桂华尹昆仲维霞徐超肖婷魏庆宽黄炳成刘功振
- 关键词：弓形虫原核表达BLOT
- 弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备 纯化及其在亚细胞定位中的应用
- 2018年
- 目的制备并纯化弓形虫微线蛋白16(TgMIC16)兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位。方法利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第14天收集兔血清,Protein A亲和纯化柱纯化,用ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测抗体效价和抗体特异性。用弓形虫RH株速殖子感染人包皮成纤维(HFF)细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,采用间接免疫荧光(IFA)检测TgMIC16在感染细胞中的定位。结果间接ELISA结果显示,制备的TgMIC16多克隆抗体滴度为1∶512 000;Western blotting结果显示,TgMIC16抗体特异性良好;IFA结果显示,TgMIC16定位在弓形虫微线体。结论本研究制备并纯化了抗弓形虫TgMIC16兔源多克隆抗体,并成功应用于TgMIC16在弓形虫微线体的免疫荧光定位。
- 魏冬冬王龙江李瑾崔勇尹昆黄炳成魏庆宽雷战孙慧
- 关键词：弓形虫多克隆抗体免疫荧光定位
- 3种方法提取血膜疟原虫DNA的比较研究被引量：1
- 2014年
- 目的对3种提取血膜疟原虫DNA的方法进行比较研究，筛选出从血膜中提取疟原虫DNA的最佳方法。方法血膜依次经过二甲苯脱油和乙醇脱色处理，然后分别采用NazHPO。法、Chelex-100法和试剂盒法提取DNA。根据疟原虫小亚基核糖体RNA编码基因（18SSSUrRNA）保守区设计套式PCR引物，分别以3种方法提取的疟原虫DNA为模板进行套式PCR扩增，并对扩增产物进行测序分析。结果疟原虫新血膜（保存1年内）3种方法提取的DNA经PCR扩增后均呈阳性且测序成功，与镜检结果一致。Chelex-100法提取的旧血膜（保存1～5年）标本和试剂盒法提取的旧血膜和陈旧血膜（保存6～10年）的DNA经PCR扩增后均呈阳性且测序成功，与镜检结果一致。结论3种方法均可成功提取新血膜疟原虫DNA，Chelex-100法可提取旧血膜的疟原虫DNA，试剂盒提取法适用于旧血膜和陈旧血膜的疟原虫DNA的提取。
- 肖婷徐超李瑾魏庆宽尹昆朱嵩孔祥礼赵长磊黄炳成
- 关键词：疟原虫血膜提取DNA
- 一种基于新型长效抗原TGIMP1C的弓形虫抗体IgG酶联免疫检测方法
- 本发明属于基因工程技术领域，具体的说是弓形虫TgIMP1C基因的原核表达和大量可溶性纯化，以及表达产物在弓形虫免疫学检测中的应用。本发明根据弓形虫TgIMP1的编码区序列，设计了可稳定表达纯化的核心结构域TgIMP1c引...
- 尹昆赵桂华徐超徐昊志谢环环代莉莎
