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山羊痘病毒双向启动子序列的克隆与鉴定被引量：2: 2011年; 为鉴定山羊痘病毒(GPV)基因组中的启动子序列,本研究预测GPV基因组中早期转录因子VETF-l和中期转录因子VITF-3基因序列之间56 bp的一段序列为双向启动子,并将其命名为Pb56。通过PCR技术将该启动子序列的两个方向(Pb56+,Pb56-)分别与绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因融合,构建重组转移重组质粒,分别命名为pUC-TK12-Pb56(+)-EGFP和pUC-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂质体转染法将2个转移重组质粒以及阴性对照pUC-TK12-EGFP及阳性对照pUC-TK12-P7.5-EGFP分别转染GPV预感染的BHK细胞;采用EGFP报告基因的表达水平评估双向启动子的活性。结果表明该基因序列的两个方向均能启动EGFP的表达,初步证实了该基因序列为GPV的双向启动子;Pb56+和Pb56-的转录活性均高于痘苗病毒的P7.5启动子。; 张娜张辉胡圣伟王安涛张沾陈创夫乔军; 关键词：双向启动子报告基因转录活性

布鲁氏菌M5-90ΔWboA基因缺失株的构建及免疫效果的初步评价被引量：11: 2011年; 为获得毒力较弱并能区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究用PCR方法扩增WboA基因的上下游同源臂序列,构建重组质粒pGEM-7zf-Δ WboA-Sac,电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选布鲁氏菌疫苗株M5-90的WboA基因缺失株,并对获得的M5-90Δ WboA遗传稳定性、毒力、免疫保护性、抗体水平等指标进行检测。实验结果表明M5-90Δ WboA株的毒力比M5-90株明显减弱,差异极显著(p<0.01),体液免疫和细胞免疫结果表明M5-90Δ WboA株与亲本M5-90株相比差异不显著(p<0.05),M5-90Δ WboA株和亲本株的保护率分别为10%和20%,表明M5-90Δ WboA株与M5-90株具有相似的保护性。凝集试验和western blot试验显示M5-90Δ WboA株免疫小鼠的血清反应结果为阴性。本研究构建的布鲁氏菌基因缺失株M5-90Δ WboA具有较好的遗传稳定性,毒力比亲本株更弱,免疫保护性与亲本株相当,并能以血清学检测方法区分野毒株感染和缺失疫苗株免疫的动物。; 张艳陈创夫张辉张沾李志强张俊波孟仁王震; 关键词：布鲁氏菌基因同源重组免疫原性

牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用被引量：4: 2010年; 以牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的保守基因5＇-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%（18/25）,与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。; 任艳陈创夫乔军王鹏雁盛金良王远志张沾李臻; 关键词：牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应子VceC功能的初步研究被引量：17: 2011年; 为研究布鲁氏菌(Brucella)Ⅳ型分泌系统效应子VceC的功能,本研究从羊种布鲁氏菌16M株基因组中克隆vceC基因片段,插入pEGFP-N1中,构建真核表达重组pEGFP-vceC。经脂质体转染HPT-8细胞,荧光显微镜观察、western blot鉴定目的蛋白在HPT-8细胞中表达情况,检测细胞凋亡、NO释放量及LDH活力。Western blot检测显示VceC在细胞中表达,转染pEGFP-vceC后的细胞凋亡、细胞上清液中NO释放量及LDH活力比对照组显著增加(p<0.05)。本研究初步表明VceC蛋白具有细胞毒性作用,为进一步研究VceC的功能奠定了基础。; 张沾陈创夫张辉张艳张娜李臻陈瑞花张豫; 关键词：羊种布鲁氏菌

布鲁氏菌Omp25对胚胎滋养层细胞炎性机制初步研究: 目的：布鲁氏菌病/(brucellosis/)/(以下简称布病/)是由布鲁氏菌引起的人、畜共患传染病,广泛分布于世界各地。布病对我国经济建设、人民健康生活、国家安全等存在着严重的威胁。布病的病原为布鲁氏菌,是一种胞内寄生...; 张沾; 关键词：羊种布鲁氏菌 RNA干扰实时定量PCR ELISA; 文献传递

布鲁氏菌WboA基因的原核表达与鉴定被引量：7: 2011年; 为了在大肠杆菌中表达布鲁氏菌的WboA蛋白,并对其进行纯化和鉴定,采用PCR方法扩增得到WboA基因DNA片段,将其克隆于pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-WboA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定及测序。结果显示:重组表达质粒pET-WboA经双酶切及测序鉴定证明构建正确。经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE、western blot分析鉴定,可见约45 ku的外源蛋白带,表明WboA基因在大肠杆菌中得到了表达。用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的WboA蛋白。; 张艳陈创夫张辉张沾陈瑞花张钰李志强张俊波; 关键词：布鲁氏菌原核表达

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张沾