吕玉民
- 作品数：11 被引量：58H指数：6
- 供职机构：河南省职业病防治研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金河南省杰出人才创新基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 盐藻hsp70a cDNA片段的克隆与分析被引量：10
- 2003年
- 根据衣藻、矮牵牛花、Pisumsativum等真核生物hsp70a氨基酸高度保守序列设计两对简并引物,以热休克盐藻cDNA为模板进行巢式PCR扩增,产物经T A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析,获得了盐藻热休克蛋白70acDNA片段。在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为372bp,编码126个氨基酸。推导的氨基酸序列与与下列物种的hsp70a比较:衣藻为96%,矮牵牛花为94%,Pisumsativum为86%,番茄为86%,人为85%,果蝇和酵母分别为84%和83%。所克隆的序列为盐藻hsp70acDNA片段。
- 姜国忠牛向丽吕玉民谢华王建民袁保梅徐培荣薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻CDNA克隆
- 盐藻肌动蛋白基因启动子驱动的bar基因表达作为核转化筛选标记(英文)被引量：5
- 2005年
- 运用基因组步行方法克隆盐藻肌动蛋白基因 5′上游调控序列,发现相对于ATG上游 -573和 -424b的位置上分别有 75bp长的两个重复序列。没有典型的TATA盒,但有两个TATA样结构、一个CCAAT结构和一个与GCTC(G/C)AAGGC一致的序列。以 700bp的盐藻肌动蛋白基因启动子区序列驱动bar基因的表达作为转化盐藻的筛选标记。转化的藻细胞暗光恢复 24h后,在含 0 5μg/mL除草剂的培养基中常规培养生长 1周,然后将细胞平铺于含 0 5μg/mL除草剂的固体培养基上继续筛选培养。约 20d后从固体培养板上挑选出 5个藻落并作了进一步培养和分析。结果显示, 5个转化藻中携带bar嵌合基因的整合位点均位于核基因组内。Southerblotting分析表明,仅有一个转化藻整合单拷贝的bar基因,而另外 4个转化藻株则包含多个拷贝bar基因片段,提示盐藻核基因转化主要是外源基因的随机整合,外源基因在转化盐藻中的整合拷贝数并不影响其除草剂抗性RT PCR方法证明了bar基因在转化藻中的转录。5个转化藻在含除草剂的液体培养基中维持生长了至少 7个月,表明核基因转化的稳定性。
- 姜国忠吕玉民牛向丽薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻BAR基因
- 杜氏盐藻DCA1启动子内GT重复序列在盐诱导调控中的作用被引量：2
- 2009年
- 为了研究杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶(DCA1)启动子中高度重复的GT序列在盐诱导表达时的调控作用,设计不同的引物,通过PCR法获得6条不同长度的DCA1启动子片段,分别与gus报告基因融合后构建6个表达载体;电击法转化杜氏盐藻细胞。组织化学染色和荧光定量法检测GUS在不同盐浓度下的瞬时表达。结果显示,DCA1启动子内高度重复的GT序列无论与其上游、下游或上下游片段同时结合均能驱动gus基因的表达,并且其表达受氯化钠浓度调控,其中和上下游均结合时活性最强;无GT重复序列的融合片段及GT重复的下游片段也能驱动gus基因的表达,但其表达不受氯化钠浓度调控;而GT重复的上游片段不能驱动gus基因的表达。结果提示:盐藻DCA1启动子中高度重复的GT序列在盐诱导调控中起重要作用,可能为一种新型的盐诱导元件。
- 罗清菊李杰闫红霞卢雪景吕玉民薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻碳酸酐酶GUS基因
- 抗草丁膦bar基因的原核表达与多克隆抗体的制备被引量：1
- 2009年
- 目的:制备抗草丁膦bar基因的原核表达系统和多克隆抗体。方法:以常规基因重组技术,将bar基因片段插入原核表达载体pET28,得到重组质粒pET28-bar,经酶切、测序鉴定正确后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,镍柱亲和纯化目的蛋白,以目的蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。结果:bar基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,占总蛋白的39.2%。以高纯度的目标蛋白作为抗原免疫小鼠,得到抗PAT的抗血清。ELISA检测抗血清效价达到1:51200,Western blot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合。结论:以纯化的bar基因表达蛋白PAT作为抗原,制备了特异性较高的抗PAT抗体。
- 宋贤瑞李杰吕玉民刘玲玲薛乐勋
- 关键词：BAR基因原核表达抗体制备
- 杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因跨内含子DNA序列的克隆和鉴定被引量：2
- 2004年
- 目的 :克隆杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶 (DCA1 )和碳酸酐酶 (CA1 )基因跨内含子基因组DNA序列。方法 :利用跨内含子PCR方法 ,从杜氏盐藻基因组中克隆DCA1和CA1基因跨内含子基因组DNA序列。结果 :DCA1基因跨内含子长度为 4 4 0 7bp ,含 7个外显子 ,由此推定的氨基酸序列长度为 5 5 5个氨基酸残基 ;而CA1基因跨内含子长度为 4 4 73bp ,含 8个外显子 ,其推定的氨基酸序列长度为 4 98个氨基酸残基。这 2种基因的所有外显子 -内含子交接点处序列都遵守GT -AG规律。结论
- 吕玉民姜国忠牛向丽谢华薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻碳酸酐酶
- 用基因枪法将bar基因导入杜氏盐藻及转基因藻株的检测被引量：11
- 2004年
- 目的 :探讨基因枪转化方法不同轰击条件和启动子的选择对转化杜氏盐藻的影响。方法 :以抗除草剂(bar)基因作为报告基因 ,用基因枪法将其导入杜氏盐藻。通过草丁膦筛选培养获得转化藻株 ,对转化藻株进行分析。结果 :在氦气压力为 1 0 0L/min条件下 ,微弹轰击 2次比微弹轰击 1次或 3次的效果都好 ;杜氏盐藻碳酸酐酶(CA1 )基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻中瞬时表达 ,而双拷贝碳酸酐酶 (DCA1 )基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻中稳定表达。结论 :在氦气压力为 1 0 0L/min条件下微弹轰击 2次 ,可能是基因枪法转化杜氏盐藻的较好转化条件。在转基因杜氏盐藻研究中 。
- 吕玉民谢华牛向丽姜国忠薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻基因枪
- 莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻中转录活性的检测被引量：8
- 2004年
- 目的 :验证莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的转录活性。方法 :以绿色荧光蛋白 (En hancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)为报告基因 ,将报告基因插入莱茵衣藻叶绿体atpA启动子与rbcL终止子之间 ,构建载体pSP71 -atpA -EGFP ,用基因枪法转入杜氏盐藻叶绿体中 ,通过荧光显微镜观察EGFP基因在atpA启动子控制下的表达 ,以验证atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性。结果 :荧光显微镜下观察到EGFP在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。结论 :莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中有转录起始活性 。
- 潘卫东吕玉民张贵星牛向丽侯桂琴薛乐勋
- 关键词：盐藻莱茵衣藻叶绿体ATPA启动子
- 杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因5’上游的克隆与序列分析被引量：10
- 2004年
- 目的 :克隆盐藻 2种碳酸酐酶基因 (DCA1、CA1 ) 5’上游区序列 ,并对其进行测序和序列分析。方法 :利用DraⅠ、EcoRV、PvuⅡ和StuⅠ 4种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA ,并与衔接头连接 ,构建成盐藻步行基因组文库GWL1、GWL2、GWL3和GWL4 ;巢式PCR方法从盐藻步行基因组文库中扩增DCA1和CA1基因 5’上游区序列 ,双脱氧末端终止法测序。结果 :DCA1基因 ,在GWL1、GWL3中分别扩增出约 1 .3kb和 4 .5kb的特异带 ,而CA1基因 ,则在GWL2、GWL4中分别扩增出 1 .7kb和 2 .5kb的特异带 ;序列分析结果表明 ,所得序列的 3’端与已知DCA1、CA1基因cDNA 5’端序列完全一致。该 2序列均有多个与转录调控有关的保守序列 (如TATA -box、CAAT -box)和富含GT的重复序列等许多相似之处。结论 :采用基因组步行方法从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的DCA1、CA1基因的 5’上游区序列 ,可能是
- 吕玉民姜国忠牛向丽谢华张贵星薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻碳酸酐酶
- 杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段的克隆与分析被引量：9
- 2004年
- 目的 :获得杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。方法 :根据Dunaliellatertiolecta、衣藻、团藻等生物硝酸盐还原酶 (nitratereductase ,NR)高度保守序列EGWWFKP、WNVMGMM设计一对简并引物 ,以含硝酸盐培养基培养的的盐藻cDNA为模板 ,进行PCR扩增 ,产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM1 0 9,经筛选后测序 ,将测序结果推导成氨基酸序列 ,并与Dunaliellatertiolecta、团藻、衣藻、小球藻等进行同源性分析。结果 :在盐藻中所获得的cDNA片段 ,核苷酸长度为 381bp ,编码 1 2 7个氨基酸。推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较 :Dunaliellatertiolecta为 88.2 %同源 ,团藻为 78% ,衣藻为 6 7% ,小球藻为 5 9%。结论 :所克隆的序列为盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。
- 谢华姜国忠吕玉民牛向丽许培荣王建民薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻硝酸盐还原酶CDNA
- 杜氏盐藻硝酸盐还原酶5’端cDNA片段的快速扩增被引量：1
- 2004年
- 目的 :根据已扩增的杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA的部分序列 ,利用 5’RACE的方法扩增其 5’上游未知片段。方法 :根据盐藻硝酸盐还原酶cDNA已知的部分序列 ,设计一条磷酸化反转录引物、2对特异性反向PCR引物。提取盐藻细胞mRNA ,利用 5’RACE的方法反转录成cDNA ,然后利用PCR方法扩增 5’上游序列 ,产物与T载体连接后转化至大肠杆菌JM1 0 9中 ,经筛选后测序 ,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果 :在盐藻中所获得的cDNA片段 ,核苷酸长度为 4 31bp ,编码 1 4 3个氨基酸。推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较 :Dunaliellatertiolecta为 83% ,衣藻为 6 8% ,团藻为 6 6 % ,小球藻为 6 4 %。结论
- 谢华许培荣姜国忠吕玉民郭玉忠薛乐勋
- 关键词：杜氏盐藻硝酸盐还原酶CDNARACE
