李雨辰
- 作品数：3 被引量：15H指数：3
- 供职机构：暨南大学抗体工程研究中心更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目广东省教育部产学研结合项目更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学农业科学更多>>
- 副溶血弧菌外膜蛋白ompK免疫磁珠检测方法的建立被引量：3
- 2013年
- 构建重组基因克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompK并制备多克隆抗体,建立副溶血弧菌的免疫磁珠富集,结合化学显色检测方法。利用生物软件Primer 5设计副溶血弧菌ompK基因的引物,通过PCR扩增出ompK基因,并将其克隆至pET28a(+)原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,免疫小鼠,制备其多克隆抗体。Western blot鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。间接ELISA检测多抗效价及交叉性,并与protein G磁珠偶联结合显色平板检测副溶血弧菌。结果显示,成功表达ompK蛋白;免疫小鼠获得特异性抗血清,效价为1∶64 000;Western blotting证明抗血清能与副溶血弧菌28 kD处条带特异性结合。制备的免疫磁珠敏感度最高能达到104CFU/mL。成功克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompK并制备副溶血弧菌特异性鼠多克隆抗体,建立的免疫磁珠检测方法与显色平板法结合较传统的二次增菌法能够节省72 h,整个过程只需要传统方法时间的1/3;相比于常用的免疫学检测方法检测灵敏度提高两个数量级。
- 李雨辰闻一鸣童吉宇向军俭
- 关键词：副溶血弧菌多克隆抗体免疫磁珠
- 单增李斯特菌InternalinA的表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：3
- 2012年
- 【目的】克隆表达单增李斯特菌膜表面蛋白InternalinA(InlA),经免疫家兔获得多克隆抗体,为建立其免疫磁珠富集快速检测方法奠定基础。【方法】利用生物软件设计单增李斯特菌inlA基因的引物,通过PCR扩增出inlA基因,并将其克隆至pET28a()原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。免疫家兔,制备其多克隆抗体。间接ELISA检测多抗的效价及交叉性,免疫荧光分析多抗与单增李斯特菌菌体结合的特异性。【结果】成功表达了InlA蛋白,融合表达产物分子量约为92 kD,质谱鉴定其为InlA蛋白;免疫家兔获得的抗血清效价为1:100 000,除与金黄色葡萄球菌约20%的交叉外,与副溶血弧菌等其它病源菌均无交叉;免疫荧光证实该多抗特异性结合于单增李斯特菌膜表面,与同种属的威尔斯李斯特菌不结合。【结论】成功制备了单增李斯特菌特异性的兔多克隆抗体,为单增李斯特菌免疫磁珠富集快速检测方法的建立奠定了基础。
- 李志清向军俭李雨辰闻一鸣杨红宇
- 关键词：单增李斯特菌多克隆抗体
- 原核表达MurA蛋白并制备其多克隆抗体用于免疫磁珠快速检测单增李斯特菌被引量：10
- 2014年
- 【目的】制备MurA多抗,结合免疫磁珠与选择平板进行单增李斯特菌的快速检测,建立单增李斯特菌的免疫磁珠快速检测方法。【方法】构建MurA的原核表达载体,转化大肠杆菌进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,再免疫小鼠,制备其多克隆抗体。用所获多抗制备免疫磁珠,建立单增李斯特菌免疫磁珠-选择性培养基检测方法,并对人工污染牛奶样品进行检测。【结果】在大肠杆菌中高效表达了分子量约为72 kD的可溶性融合蛋白,质谱鉴定其为MurA蛋白;免疫小鼠获得的抗血清效价达1:10 000,与伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、大肠杆菌及属内其它病原菌均无交叉;所建立的免疫磁珠-选择性培养基检测法可检出浓度为103 CFU/mL及以上的单增李斯特菌,仅与英诺克李斯特菌存在一定交叉反应;牛奶样品单次仅需9 h增菌就能被检出,较常规增菌时间缩短39 h;检测限为0.4 CFU/mL。【结论】表达并纯化得到高纯度的单增李斯特菌MurA蛋白,制备的鼠源多克隆抗体亲和力高,特异性好;建立了快速检测单增李斯特菌的免疫磁珠联合选择性培养基法,在灵敏度不变的情况下,实现24 h内成功对牛奶样品的检测,较国标法减少42 h以上。
- 童吉宇李志清闻一鸣李雨辰向军俭
- 关键词：单增李斯特菌多克隆抗体免疫磁珠
