王茂鹏
- 作品数：32 被引量：57H指数：4
- 供职机构：军事医学科学院军事兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点实验室开放基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 重组PCV3 Cap蛋白植物乳杆菌的构建与表达验证被引量：6
- 2019年
- 构建3型猪圆环病毒(PCV3)Cap蛋白的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含1320信号肽和DCpep优化的PCV3 Cap基因(PCV3D),使用无缝克隆技术连接到pSIP411载体中,电转入克隆宿主乳球菌NZ3900中,提取测序结果正确的重组表达质粒NZ3900:pSIP411-PCV3D再次电转入植物乳杆菌Lp12,制备重组菌并验证其表达。结果显示:成功扩增出目的条带为789 bp的经过修饰和优化的PCV3 Cap基因(PCV3D)片段,重组表达质粒电转入植物乳杆菌Lp12,成功构建重组植物乳杆菌Lp12:pSIP411-PCV3D。Western blot、流式细胞术等方法检测重组蛋白表达,获得阳性结果,阳性率为47.9%;免疫荧光进一步表明重组蛋白能够在细胞中表达。本试验成功构建了1株表达PCV3 Cap蛋白的植物乳杆菌,为PCV3口服候选疫苗的开发研究提供依据。
- 付婷婷李昌王茂鹏许汪韩继成马彬尧秦爱建金宁一
- 关键词：CAP蛋白植物乳杆菌
- HIV-1 B亚型假病毒的制备与鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的制备携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和ENV包膜蛋白的HIV-1 B亚型假病毒用于感染研究,并建立可行的鉴定方法。方法双质粒共转染HEK293T细胞后收获病毒上清,TRIzol法提取病毒基因组并采用RT-PCR进行报告基因扩增,Western印迹和ELISA法检测病毒P24抗原。假病毒感染HIV-1允许细胞,进行报告基因检测、病毒滴度测定以及单轮感染活性实验研究。结果与结论建立了HIV-1假病毒制备与鉴定方法,制备获得了B型HIV-1假病毒,经鉴定具备感染SupT1和TZM-bl细胞能力,为HIV-1与宿主细胞相互作用研究奠定了基础。
- 王茂鹏李昌杜寿文朱羿龙朱娜孙丹丹金宁一
- 关键词：HIV-1
- 乳酸菌表达CRISPR gRNA载体的构建与鉴定被引量：1
- 2017年
- [目的]构建并筛选重组gRNA(向导RNA)表达质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX,并对gRNA在乳酸菌中的表达进行鉴定。[方法]通过PCR技术扩增复制子SH71、氯霉素抗性基因CM和gRNA表达盒片段。将CM片段分别与gRNA表达盒进行融合,再与SH71复制子进行无缝克隆。通过转化,构建重组质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX。应用PCR、RT-PCR、Real-Time PCR对重组质粒进行鉴定,gRNA表达验证及拷贝数检测。[结果]PCR及RT-PCR结果显示获得169 bp大小目的条带,表明获得重组质粒载体且该gRNA表达载体在植物乳杆菌WCFS1株、CGMCC1.557株、乳酸乳球菌MG1363株中均成功表达,绝对荧光定量PCR检测获得LDH-gRNA标准曲线为y=-3.480log X+45.34,扩增效率为93.8%;C9PX-gRNA标准曲线为y=-3.327log X+37.07,扩增效率为99.8%。[结论]为利用CRISPR基因编辑技术在乳酸菌中进行基因操作奠定基础,为乳酸菌载体构建提供方法。
- 邸洋王茂鹏李昌潘荣荣荣凤君杜寿文朱羿龙郭焱金宁一
- 关键词：乳酸菌重组表达质粒CRISPR
- IFITM2的克隆表达及其抗病毒作用初探
- 2013年
- 目的:构建含有ifitm2基因的重组质粒,在人胚肾HEK293T细胞中表达,并验证IFITM2蛋白的抗病毒作用。方法:参照Genbank ifitm2基因序列,设计上下游引物,通过RT-PCR技术扩增ifitm2基因,并将扩增产物连接至pMD18-T-sim-ple载体上,目的基因测序正确后进一步亚克隆至真核表达载体pVAX1上,转染HEK293T细胞,通过RT-PCR,蛋白免疫印迹(Western blot)和激光共聚集显微镜(LCSM)验证外源基因在细胞内的表达情况。同时HEK293T细胞过表达IFITM2蛋白,利用含有EGFP基因的VSV-G假膜病毒感染细胞,通过Western blot检测IFITM2蛋白对病毒的抑制作用。结果:成功获得ifitm2基因,测序正确,将其连接到pVAX1载体中,经酶切鉴定,证明含有ifitm2基因的重组质粒构建成功,Western blot和LCSM分析表明,目的基因能够在HEK293T细胞中表达,且呈广泛分布。过表达IFITM2蛋白后,荧光蛋白分析表明,该蛋白对病毒感染具有一定的抑制作用。结论:成功构建了含有ifitm2基因的重组真核表达质粒,该质粒可以在真核细胞中得到有效表达,且对VSV-G假膜病毒具有一定抑制作用,该研究为进一步探讨IFITM2蛋白的抗病毒作用及其分子机制提供了实验及理论基础。
- 李沂李昌杜寿文王茂鹏朱羿龙刘存霞秦艳青金宁一
- 关键词：克隆表达抗病毒作用
- IFITM1/2/3敲低细胞株的构建与筛选
- 目的 干扰素诱导的跨膜蛋白1/2/3 (interferon induced transmembrane proteins,IFITM1/2/3)是2009年Cell首次报道的具有抗病毒活性的蛋白,目前已发现其对9个科的...
- 李昌杜寿文王茂鹏谭鹏刘存霞朱羿龙金宁一
- 基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析被引量：1
- 2017年
- 利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3^+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3^+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.
- 曹婷婷杜寿文许汪邢彬赵飞王茂鹏朱羿龙白杰英田宇飞刘立明赵翠青周义发李昌金宁一
- 人树突状细胞分离与鉴定最新研究进展被引量：3
- 2013年
- 树突状细胞（dendriticcell，DC）是最重要的抗原提呈细胞．在许多疾病过程中发挥免疫调节作用。DC的发现者Steinman对它在获得性免疫中的作用进行了深入研究。Beutler深人探讨了DC在固有免疫中的作用．2011年他们以此获得诺贝尔生理或医学奖，充分表明DC在免疫学领域的重大意义。
- 王茂鹏杜寿文李昌金宁一
- 关键词：树突状细胞细胞分离诺贝尔生理或医学奖抗原提呈细胞获得性免疫疾病过程
- 乙型脑炎病毒可视化分型基因芯片的制备被引量：2
- 2014年
- 目的:制备乙型脑炎病毒(JEV)可视化分型基因芯片。方法:根据JEV的基因组序列,应用生物学软件设计JEV分型引物及探针,制备其可视化分型基因芯片;用生物素标记的引物PCR扩增目的片段,并与固定于玻片上的探针杂交,加入链霉亲和素标记的纳米金,银增强实现可视化;进行特异性、灵敏性及重复性试验。结果:探针特异地与相应的标记目的基因片段杂交,并在芯片上呈现较强的阳性杂交信号;2号探针能特异性检出JEV,3、4号探针可分别对Ⅰ型和Ⅲ型JEV进行分型;芯片对JEV质粒检测的灵敏度达105拷贝/mL;以蓝耳病病毒等5种病毒为对照,芯片只对JEV响应,具有特异性;制备的基因芯片具有批间、批内重复性。结论:制备的基因芯片具有高特异性、灵敏性及重复性,可以快速、准确、高通量地对JEV进行可视化分型检测。
- 薛斐辛舒田宇飞孙文超温树波阎富龙盛媛王茂鹏朱羿龙田明尧金宁一
- 关键词：乙型脑炎病毒基因型基因芯片可视化
- 山羊痘病毒GTPV-AV41的TK基因缺失株构建
- 朱羿龙杜寿文王茂鹏赵飞白冰曹婷婷邸洋许汪邢彬李昌金宁一
- 乳酸菌破壁方法的比较研究被引量：9
- 2017年
- 本实验旨在探索一种快速、高效、经济的乳酸菌破壁方法。通过甘氨酸破壁法、反复冻融破壁法、溶菌酶破壁法、氧化锆珠破壁法、超声波破壁法以及3种复合破壁法对植物乳杆菌Lactobacillus.plantarum 1.557进行破壁处理,并以革兰氏染色和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为评价方法,比较破壁效果和破壁时间的差异。此外,通过β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活力的测定对氧化锆珠破壁法所提蛋白进行活性检测,通过琼脂糖凝胶电泳对氧化锆珠破壁法所提RNA的质量进行了检测。结果表明:氧化锆珠破壁法优胜于其他几种处理方法,该法所提取的GUS蛋白具有蛋白活性,提取的RNA的OD_(260)/OD_(280)的比值在1.8~2.1之间,符合标准的比值,纯度较高,降解程度低。因此,氧化锆珠破壁法适用于快速提取乳酸菌菌体蛋白和总RNA,它是一种快速、高效、经济的乳酸菌破壁方法。
- 潘荣荣王茂鹏李昌邸洋荣凤君杜寿文朱羿龙刘立明朱国强金宁一
- 关键词：乳酸菌蛋白提取RNA提取
