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动物外周血单个核细胞分离方法探讨被引量：4: 2010年; 目的探索用人淋巴细胞分离液分离多种属动物外用血单个核细胞（PBMCs）的可行性及评价其分离效果,建立一种适于野外大规模多种属动物PBMCs的分离方法.方法采用人淋巴细胞分离液分离来源于新疆的伊犁马、新疆驴、不同品种犬、新疆双峰驼、天山马鹿和来源于重庆的荣昌猪、中国荷斯坦奶牛、简阳大耳黑山羊外周血PBMCs.随机抽样检测分离的动物PBMCs细胞总数、细胞纯度和细胞活率.结果用人淋巴细胞分离液成功分离上述8种动物PBMCs,每毫升动物外周血分离的PBMCs细胞总数为0.52×106～2.03×106个,纯度为67%～93%,细胞活率为92.5%-98.0%.结论用人淋巴细胞分离液分离多种动物PB-MCs的方法宜在动物的病毒分子流行学调查中进一步推广.; 胡永波展群岭刘海朋霍康杨德雨徐鸣明张英英何丰胡子成谢鹏; 关键词：动物细胞分离

新疆伊犁地区动物脑内博尔纳病病毒和西尼罗病毒感染的分子流行病学研究: 博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）是一种非分段单股负链RNA病毒，在感染细胞的细胞核内复制和转染。Borna病毒基因组相对分子量为8.9×103，具有6个开放阅读框架，能编码核蛋白（p40）、...; 何丰; 关键词：博尔纳病病毒西尼罗病毒分子流行病学神经症状; 文献传递

牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒检测结果的比较被引量：6: 2010年; 目的检测同一牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒(BDV)p24片段,比较两者阳性率的差异。方法采用改进的荧光定量套式RT-PCR,对新疆伊犁地区圈养的100只牧羊犬外周血单核细胞(PBMC)和脑组织(BT)同时进行BDV p24基因片段的检测,并对阳性标本采用GFP-p24、pMD-19扩增后电泳验证,排除质粒污染,并克隆测序,用Fisher精确检验和χ2检验分析两者阳性率的差异。结果牧羊犬外周血单核细胞和脑组织BDV p24检测的阳性率分别为5%和9%;PBMC组和BT组BDV p24检测阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论BDV在脑内持续感染,但以RT-PCR对外周血单核细胞BDV p24片段的检测有可能替代脑组织BDV检测,作为大规模流行病学调查的手段。; 何丰冯裕星孙后超展群岭谢鹏; 关键词：博尔纳病病毒外周血脑组织

新疆伊犁地区动物脑组织博尔纳病病毒p24基因片段的检测被引量：2: 2010年; 目的了解新疆伊犁地区动物脑博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）感染现状，分析该病毒的种系来源，预防我国BDV大规模暴发流行。方法采用巢式逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—RT-PCR）的方法，对新疆地区200匹马、75头驴和100只牧羊犬脑组织标本进行BDVp24基因片段的检测。并对阳性标本进行BDV p40基因片段扩增电泳，同时排除GFP—p24和pMD-19质粒污染，最后克隆测序，进行基因同源性和氨基酸序列分析并分析BDV种系发生。结果3例伊犁马、4例伊犁驴和9例牧羊犬的脑组织标本BDV p24检测阳性，阳性率分别为1．5％、5．3％、9．0％；BDV p40基因片段检测和质粒标准品GFP—p24、pMD-19检测均为阴性；BDV pPA扩增产物序列与He／80株的同源性为100％。结论新疆伊犁地区马、驴和狗可能存在BDV脑内的自然感染，该地区BDV流行株与He／80株存在同源性。; 何丰冯裕星孙后超胡子成徐红波徐鸣明展群岭胡永波金戈张英英李雷雷谢鹏; 关键词：博尔纳病病毒脑组织

博尔纳病病毒实时荧光定量PCR诊断试剂盒的评价与应用被引量：1: 2009年; 目的评价博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)实时荧光定量PCR(FQ RT-PCR)试剂盒的各项指标,并了解其实际应用效果。方法使用BDVOL持续感染细胞株、非BDV病毒序列转染的OL细胞、正常的OL细胞,对BDV RT-PCR试剂盒的敏感性、特异性、重复性和稳定性进行评估,同时检测部分临床病人和动物外周血液RNA。结果试剂盒可以检测出的病毒RNA最低浓度为102,相当于1.5个病毒拷贝数。特异性好,无非特异检出。不同批次的试剂盒的检测结果变异系数接近1。加速破坏的试剂盒和正常试剂盒检测结果之间变异系数在2以内。对临床病人检测阳性率为3.6%,对动物检测阳性率为4.4%。结论试剂盒敏感性、特异性、重复性和稳定性均佳,是BDV基础研究、流行病学调查、临床检测的良好工具。; 徐鸣明展群岭张英英何丰冯裕星张亮金戈李雷雷谢鹏; 关键词：博尔纳病病毒实时荧光定量PCR 检测试剂盒

博尔纳病病毒的生物学特点以及检测方法被引量：7: 2010年; 1博尔纳病病毒概况远在18世纪末博尔纳病病毒（Borna Disease Virus,BDV）就在德国南部出现散发感染,但是没有正式命名。1895年在萨克森州博尔纳镇突然出现了大量马匹死亡的事件,其中包括了一个骑兵团的军马。; 徐鸣明张英英展群岭孙后超冯裕星何丰李雷雷谢鹏; 关键词：博尔纳病病毒生物学特点

新疆伊犁地区动物脑组织西尼罗病毒E基因片段的检测: 2010年; 目的了解新疆伊犁地区动物中西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)感染现状,为我国WNV的防治提供资料。方法采用一步法实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),对采自新疆伊犁地区的70头驴和100只牧羊犬的脑组织进行WNV包膜蛋白(E)基因片段检测。结果 70头驴和100只牧羊犬脑组织标本的西尼罗病毒包膜蛋白基因片段检测有2例可疑阳性,但经3%凝胶电泳法再次验证后排除。故所有待检样本WNV包膜蛋白基因检测均为阴性。结论我国新疆伊犁地区的驴和牧羊犬脑组织中未检测到WNV的感染。; 何丰徐红波展群岭冯裕星孙后超胡子成谢鹏; 关键词：西尼罗病毒实时荧光定量RT-PCR

巢式荧光定量RT-PCR检测中枢神经系统HCV方法的构建被引量：1: 2009年; 目的建立丙型肝炎病毒5′NCR基因的巢式荧光定量RT-PCR检测方法,用于中枢神经系统感染超低浓度HCV的准确和快速定量检测。方法选择高度保守区5′NCR基因片段,设计并合成相应的特异性引物和探针,建立巢式荧光定量RT-PCR检测中枢神经系统感染样本中的超低浓度HCV正负链RNA的方法。并对32例血清HCV抗体检查阴性的病毒性脑炎患者脑脊液有核细胞和外周血单个核细胞(PBMC)进行检测。结果可特异性地检出脑脊液有核细胞及PBMC中HCV正负链RNA,最低检出浓度均可达7.85 cop ies/μl,与其他单股正链RNA病毒如登革热病毒(DEV)无交叉反应。32例血清HCV抗体检查阴性样本脑脊液有核细胞和PBMC中HCV5′NCR正链片段阳性的分别为1例(1/32)和2例(2/32),负链片段阳性的分别为1例(1/32)和0例(0/32)。结论本方法的构建适用于中枢神经系统感染超低浓度HCV正负链RNA检测,且快速有效、敏感性和特异性较高,不易出现假阳性,可有效提高检出率,进一步完善目前临床常规检测HCV的方法。; 冯裕星何丰孙后超徐红波胡子成展群岭徐鸣明张亮胡永波李雷雷谢鹏; 关键词：丙型肝炎病毒荧光定量RT-PCR 外周血单个核细胞

博尔纳病毒P24转染后不同时期核酸和蛋白的表达及细胞定位被引量：4: 2010年; 目的通过观察博尔纳病毒(borna disease virus,BDV)磷蛋白(P24)及其编码核酸不同时期的表达和细胞定位,探索BDV潜伏感染的机制。方法构建包含BDV GFP-P24质粒的OL细胞模型,检测并比较不同时期P24核酸和蛋白的表达;对构建的OL细胞模型和各种阴性对照进行逆转录原位PCR的检测,观察P24蛋白编码核酸的细胞定位;使用倒置荧光显微镜观察OL细胞中P24蛋白的细胞定位。结果成功构建了含BDV GFP-P24质粒的OL细胞,发现转染后20代以内细胞P24核酸和蛋白的表达差异不显著(P>0.05);BDV的P24重组蛋白基因始终定位于细胞核,其蛋白早期在细胞核出现,反复传代约15次后可同时在细胞核和细胞质内出现。结论BDV的重组蛋白P24在病毒感染过程中起关键作用,其编码基因始终存在于宿主细胞核内,但表达的蛋白可以在一定时期通过核膜进入细胞质。; 徐鸣明张英英展群岭何丰张亮金戈宋哲李亚军李雷雷谢鹏; 关键词：磷蛋白

逆转录原位PCR检测博尔纳病病毒感染: 2009年; 目的:建立逆转录原位PCR检测博尔纳病病毒(BDV)的方法,并与其它检测方法进行比较.方法:构建包含BDV GFP-P24质粒的模拟BDV感染的OL细胞模型,检测其核酸的表达.对构建的OL细胞模型和各种阴性对照进行逆转录原位PCR的检测.使用逆转录原位PCR、荧光定量PCR和ELISA对BDV阳性的人和动物样本及阴性对照进行检测,并比较检测结果.结果:成功构建了含BDV-GFP-P24质粒模拟BDV感染的OL细胞.建立了逆转录原位PCR检测BDV的方法;对荧光定量PCR和ELISA的检测呈阳性的4个病例和检测呈阴性的10个病例,使用原位PCR检测可以得到基本一致的结果.结论:逆转录原位PCR原位可以用于检测人和动物的BDV感染和BDV感染机制研究.; 徐鸣明张英英展群岭何丰张亮金戈宋哲李亚军谢鹏; 关键词：荧光定量PCR

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何丰

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