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Neurturin基因的克隆及其在Vero细胞中的表达被引量：1: 2008年; 目的克隆Neurturin(NTN)基因,并在Vero细胞中表达。方法用RT-PCR方法扩增hNTN cDNA,并克隆至pcDNA3真核表达载体中,经Lipofectamine2000转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对转染后细胞的形态及生长状况进行分析。结果重组质粒pcDNA3/hNTN转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆,且有目的蛋白表达,转染后细胞形态和生长特性发生了一定改变。结论获得了稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,为其移植并进行帕金森病猴基因治疗动物实验奠定了基础。; 马开利孙茂盛施锐张莹杨芳奎翔谭振国李鸿钧; 关键词：VERO细胞克隆帕金森病

神经营养因子Neurturin在Vero细胞中的表达及其生物学活性研究: 2009年; 目的探讨Neurturin(NTN)基因转染Vero细胞后的表达情况,为恒河猴帕金森病(PD)基因治疗打下基础。方法将表达载体pcDNA3-hNTN转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对表达的人NTN蛋白进行了体外生物学活性测定。结果pcDNA3-hNTN质粒转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆且有目的蛋白hNTN表达,表达的hNTN在体外能够促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,并能促进体外培养的胚胎中脑多巴胺能神经元的存活。结论获得了能稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,其表达的hNTN对体外培养的中脑多巴胺能神经元具有保护作用,为移植并进行PD猴基因治疗动物实验打下了基础。; 谢天宏马开利尹娜施锐王晚璞王文举严敏孙茂盛李鸿钧; 关键词：NEURTURIN VERO细胞生物学活性帕金森氏病

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定被引量：18: 2008年; 目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。; 尹娜李鸿钧彭梅谢天宏张光明施锐孙茂盛; 关键词：抗菌肽 CECROPIN 毕赤酵母分泌表达

人鼻病毒3C蛋白酶基因的克隆、表达、纯化及活性被引量：5: 2007年; 目的获得重组3C蛋白酶,开发一种新型的基因工程工具酶。方法通过RT-PCR方法获得人鼻病毒3C蛋白酶基因,克隆入表达载体pBV220,构建非融合表达载体pBV220-3C,转化大肠杆菌BL21(Gold)进行表达。表达产物经变性阳离子交换层析纯化后复性,再经Superdex-75凝胶过滤进一步纯化,获得的3C蛋白酶在4℃条件下,酶切融合蛋白IL-11,进行活性测定。结果3C蛋白酶在大肠杆菌中获得了稳定、高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25%,以包涵体形式存在。经过纯化、复性,纯度达90%以上,获得的3C蛋白酶能够有效切割含3C酶切位点的融合蛋白。结论已成功开发了一种新型的基因工程工具酶。; 李鸿钧王文举施锐张光明李敏马雁冰孙茂盛; 关键词：蛋白酶工具酶基因工程

腺病毒介导TRAIL基因治疗裸鼠皮下肺癌细胞移植瘤: 2007年; 为探讨重组腺病毒介导TRAIL基因通过瘤内注射治疗裸鼠皮下非小细胞肺癌细胞移植瘤的疗效及作用机制.以20只Balb/c裸鼠皮下接种建立裸鼠皮下人非小细胞肺癌细胞移植瘤模型,当瘤体直径达到0.5 cm时随机分成4组,分别为PBS组(Ⅰ)、空载体病毒Ad组(Ⅱ)、重组腺病毒Ad-TRAIL组(Ⅲ),sTRAIL组(Ⅳ).每隔2d注射1次,共注射4次.观察各组瘤体生长情况及免疫组化(TUNEL)法测定肿瘤组织细胞凋亡的情况.结果与对照组(Ⅰ),(Ⅱ)比较,第(Ⅲ),(Ⅳ)经治疗后肿瘤的生长速度明显减慢,肿瘤体积存在显著差异(P<0.05).TUNEL法检测原位肿瘤组织细胞凋亡,第Ⅲ,Ⅳ组的凋亡细胞明显比第Ⅰ,Ⅱ组多.重组腺病毒介导TRAIL基因能够通过引起细胞凋亡有效地抑制肿瘤的生长.; 杨芳李鸿钧李亮助易山施锐孙茂盛; 关键词：基因治疗重组腺病毒 TRAIL 裸鼠

重组TRAIL腺病毒抑制肺癌细胞生长和诱导凋亡的作用被引量：5: 2007年; 目的:研究重组TRAIL腺病毒(Ad-TRAIL)对人非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460抑制生长和诱导凋亡的作用,探讨Ad-TRAIL用于非小细胞肺癌基因治疗的可能性。方法:培养肿瘤细胞,分别加入Ad-TRAIL、sTRAIL,并设Ad、PBS作对照。倒置显微镜、吖啶橙染色后荧光显微镜、电镜进行细胞形态结构观察;肿瘤细胞生长抑制实验检测细胞存活率,绘制肿瘤细胞生长抑制曲线;DNA凝胶电泳、PI染色、TUNEL染色和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡;集落形成实验观察肿瘤细胞集落形成能力。结果:Ad-TRAIL组、sTRAIL组与空腺病毒Ad组、PBS阴性对照组相比均明显抑制非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460的增殖。DNA凝胶电泳出现DNA梯形条带;形态学观察发现Ad-TRAIL组的肿瘤细胞具有细胞凋亡的形态;Ad-TRAIL作用的YTMLC细胞有较高比例(8.55%)的亚二倍体凋亡峰,而Ad和PBS组分别为1.08%和0.47%;Ad-TRAIL组被TUNEL标记的细胞比例为10.6%,高于Ad组的1.13%。Ad-TRAIL组的集落数为28±7,而PBS和Ad对照组分别为257±18,193±12。结论:Ad-TRAIL对非小细胞肺癌细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用,Ad-TRAIL有可能用于非小细胞肺癌的基因治疗。; 杨芳孙茂盛易山谢天宏施锐李鸿钧; 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体重组复制缺陷型腺病毒凋亡非小细胞肺癌

重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定被引量：3: 2007年; 目的构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体。方法以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)。氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录。以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml。经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致。流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。; 杨芳易山李鸿钧谢天宏施锐孙茂盛; 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体重组腺病毒基因治疗

两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其免疫原性比较: 2007年; 目的:利用毕赤酵母表达系统表达两种融合形式的乙肝病毒表面抗原(HBsAg-s和s-HBsAg),并对融合蛋白的免疫原性进行研究。方法:用毕赤酵母分泌型表达质粒pPIC9k为载体,通过PCR方法引入(Gly4Ser)3连接肽的编码基因将GM-CSF融合到HBsAg基因的3′端或5′端进行分泌表达,表达产物以SDS-PAGE及Western blot进行分析并通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱进行蛋白纯化。将纯化的两种融合蛋白与单纯的HBsAg蛋白分别免疫小鼠,ELISA方法检测HBsAg特异的抗体反应水平。结果:两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白均可在毕赤酵母菌株GS115中获得了分泌表达,Western blot分析表明表达产物能够与抗GM-CSF抗体及抗HBsAg抗体发生特异性结合。免疫后的血清ELISA结果显示,相比单纯的HBsAg蛋白,两种融合蛋白可以诱导出更高的抗体水平(P<0.05),其中将GM-CSF蛋白融合在HBsAg蛋白的C端效果要好于融合在N端。结论:通过与GM-CSF蛋白的融合可以显著增强HBsAg的免疫原性,这为提高乙肝疫苗的免疫效果提供了新的思路与方法。; 易山席晓蓉施锐杨芳李敏李鼎锋孙茂盛; 关键词：HBSAG GM-CSF 融合蛋白毕赤酵母免疫原性

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