毕杨
- 作品数：98 被引量：190H指数：5
- 供职机构：重庆医科大学附属儿童医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金国家临床重点专科建设项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学文化科学历史地理更多>>
- β-catenin协同BMP9诱导骨肉瘤TE85细胞成骨分化被引量：1
- 2015年
- 目的:检测β-连环蛋白(β-catenin)联合骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对骨肉瘤TE85细胞成骨分化的影响。方法 :采用构建有β-catenin和BMP9基因的重组腺病毒Adβ-catenin和Ad BMP9,单独或联合感染人骨肉瘤TE85细胞,并用半定量RT-PCR法检测β-catenin和BMP9 m RNA在TE85细胞中表达水平的改变;荧光素酶报告基因系统检测β-catenin/TCF4相对活性的变化,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和读数法分析TE85细胞的早期成骨能力,茜素红染色法检测细胞的晚期成骨能力;半定量RT-PCR法检测骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)以及晚期成骨分化指标骨钙蛋白(osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)m RNA的表达水平,蛋白质印迹法检测OC和OPN蛋白的表达水平。结果:重组腺病毒Adβ-catenin与AdBMP9感染TE85细胞后能显著提高外源性β-catenin与BMP9 mRNA的表达水平(P值均<0.05),Adβ-catenin能明显增强β-catenin/TCF4的相对活性(P<0.05)。Adβ-catenin与AdBMP9能分别诱导骨肉瘤细胞TE85早期成骨分化指标ALP活性增加(P<0.05),但增加的程度有限;对晚期成骨指标OC和OPN mRNA和蛋白表达以及钙盐沉积无明显上调的作用。Adβ-catenin与AdBMP9联合作用之后,上述各项早晚期成骨指标的表达均显著增强,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论:β-catenin和BMP9单独诱导骨肉瘤细胞TE85成骨分化的能力有限,而联合作用后诱导成骨分化的能力显著增强,β-catenin能协同BMP9诱导骨肉瘤细胞TE85成骨分化。
- 罗光金罗庆毕杨张璇迭小红仇超刘敏康权
- 关键词：骨肉瘤Β-连环蛋白腺病毒感染
- 转录因子Twist的siRNA筛选、腺病毒构建及功能检测被引量：4
- 2010年
- 目的 筛选特异性沉默人的Twist基因的siRNA序列,构建siTwist腺病毒并在MG63及143B骨肉瘤细胞中进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组siTwist双链DNA序列,克隆至含有Twist基因的pSOS-Twist质粒中获得pSOS-siTwist质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的siTwist片段,将筛选出的siTwist序列构建腺病毒,感染143B骨肉瘤细胞.通过RT-PCR、Western 印迹检测Twist的表达.siTwist与Twist腺病毒共感染MG63骨肉瘤细胞,细胞计数及细胞侵袭实验检测siTwist对Twist的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,4组siTwist中有2组GFP的表达明显降低,且siTwist腺病毒能抑制143B骨肉瘤细胞中内源性的Twist表达,Twist腺病毒能促进MG63骨肉瘤细胞的增殖和转移,而两组siTwist与Twist共感染组MG63细胞的增殖及迁徙率均明显低于Twist组（P〈0.05）.结论 筛选出两对特异性沉默Twist基因的siRNA片段,并成功构建腺病毒,转染细胞后能有效抑制内源性和外源性的Twist表达,为研究Twist在骨肉瘤细胞增殖和转移中的作用及具体机制提供了有效的分子工具.
- 何昀毕杨刘星袁心刚魏光辉
- 关键词：TWIST基因腺病毒小干扰RNA
- 显性负性突变体对AP2α转录因子及其活性的影响被引量：4
- 2011年
- 转录蛋白2α(activator protein-2α,AP2α)的转录活性可能是全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)神经分化的关键调控点,但具体机制尚不清楚,显性负性突变是研究基因功能的一个经典手段.以携带AP2α全长基因的pAd-AP2α质粒为模板,分别扩增缺失bHLH及缺失TAD区域的AP2α片段,采用AdEasy腺病毒包装系统获得两种AP2α缺失型显性负性突变体重组腺病毒Ad-dnAP2α-△bHLH及Ad-dnAP2α-△TAD,腺病毒感染ATRA诱导24 h的大鼠MSCs可观察到60%以上RFP阳性细胞.Real-time-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示AP2α定位于MSCs细胞核,经A-TRA诱导24 h,AP2α的表达无变化,而其下游基因bcl-2及c-kit表达增高,两种缺失型显性负性突变体腺病毒感染MSCs对野生型AP2α的mRNA及蛋白表达没有影响,却能有效抑制AP2α对下游靶基因bcl-2和c-kit的转录激活作用.为进一步研究AP2α转录活性在ATRA诱导MSCs成神经分化中的作用提供重要的分子手段.
- 毕杨何昀龚敏张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒骨髓间充质干细胞
- 质粒FGF-2磁性壳聚糖明胶微球对间充质干细胞增殖分化的影响被引量：3
- 2015年
- 本研究目的是探讨超顺磁性壳聚糖FGF-2明胶微球(SPCFGM)对小鼠间充质干细胞增殖分化作用的影响。采用化学共沉淀法制备超顺磁性氧化铁壳聚糖纳米粒子(SPIOCNs),与质粒FGF-2结合后,用乳化交联法制备SPCFGM和不含质粒FGF-2的超顺磁性壳聚糖明胶微球(SPCGM),激光粒度分析仪和透射电镜检测SPCFGM、SPIOCNs表征,测定SPCFGM的载药量、包封率及体外释放活性,分别用等量SPCFGM、SPCGM、加入C3H10细胞培养基中,设SPCFGM组、SPCGM组、空白对照组3组细胞。DAPI染色观察细胞凋亡,Western blot法验证各组FGF-2的表达水平,CCK8法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布。结果显示:SPIOCNs微粒和SPCFGM微球都呈球形,粒径分别为(25±9)nm和(140±12)μm。SPCFGM的载药量为57.13%±5.41%,包封率为69.97%±0.04%。3组细胞无凋亡形态,SPCFGM组FGF-2蛋白水平表达较其它两组明显增高,细胞增殖活力明显增高(P<0.05)。SPCFGM可释放FGF-2,并保持FGF-2的生物活性,促进C3H10细胞增殖分化,对细胞无毒副作用。
- 丁幸坡李明曹豫江杨琼何通川罗聪李海冰毕杨
- 关键词：明胶微球间充质干细胞增殖分化
- 人尿源性干细胞及人脐带间充质干细胞的生物学性状比较被引量：3
- 2020年
- 该研究探讨人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)及人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的生物学性状差异。分离培养hUSCs及hUC-MSCs,显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测干细胞表面标记物,锥虫蓝拒染实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色、油红O染色及阿利新蓝染色评估多向分化潜能。hUSCs为米粒状贴壁生长细胞,hUC-MSCs为长梭形贴壁细胞,呈旋涡状排列生长,两种细胞表型分析相似,均表达多种间充质干细胞标志物,但CD24在hUC-MSCs表达阳性,而CD105在hUSCs表达阳性。hUC-MSCs的增殖及迁移能力优于hUSCs,但后者的克隆形成能力更强。hUSCs及hUCMSCs都具有成骨、成脂、成软骨分化能力,hUC-MSCs的成骨能力强而hUSCs的成脂能力强。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的hUSCs,该细胞与hUC-MSCs相比具有相似的生物学性状,可作为再生医学自体移植的理想种子细胞来源。
- 胡超群方姝煜龚梦嘉毕杨何昀
- 关键词：人脐带间充质干细胞多向分化
- 腺病毒载体介导的HBx表达对HepG2细胞中PPARγ定位的影响
- 目的:检测外源基因 HBx 转入 HepG2细胞后对 PPARγ表达定量及定位的影响。方法:以 HBx 重组腺病毒感染 HepG2细胞,分别用 RT-PCR 和总蛋白 Western blot 检测 PPARγ
- 黄佳祎毕杨左国伟冯涛
- 关键词：HBXPPARΓ曲格列酮
- siCBP慢病毒降低大鼠原代海马神经元乙酰化组蛋白表达被引量：1
- 2015年
- 本研究目的为构建携带针对大鼠环磷酸腺苷反应元件结合因子的结合蛋白(CBP)基因的siRNA重组慢病毒,感染原代海马神经元并检测其对乙酰化组蛋白表达的抑制作用。本文构建了4种siCBP,并检测其对神经元中CBP表达的抑制作用,选择效果最好的一种检测神经元中HAT活性及乙酰化组蛋白Ac-H3、Ac-H4的表达。酶切及测序鉴定证实siCBP正确克隆至慢病毒质粒中,4种siCBP感染原代海马神经元后CBP mRNA和蛋白表达有不同程度降低,效果最佳的GR806对神经元的HAT活性及Ac-H3、Ac-H4表达均有显著抑制作用。本研究为后续应用siCBP阐明CBP依赖的组蛋白乙酰化对海马区学习记忆功能调节的相关分子机制提供了实验工具。
- 侯娜丽吴小凤任兰郭敏毕杨刘友学陈洁黄鸿眉李廷玉
- 关键词：慢病毒载体海马神经元组蛋白乙酰化
- Notch信号通路相关分子在脊椎生长过程中的差异表达及其对软骨细胞分化的调控作用被引量：3
- 2013年
- 目的探讨Notch信号通路相关分子在脊椎生长过程中的差异表达及其对软骨细胞分化的调控作用。方法采用RT-PCR检测各不同发育年龄段小鼠椎间盘Notch信号分子mRNA的表达情况,筛选调控脊椎正常生长发育的重要信号分子,并采用免疫组化法进行验证。用重组腺病毒介导Dll-1、Jag-1、骨形态发生蛋白-2(bone morphogeneticprotein-2,BMP-2)在髓核(nucleus pulposus,NP)细胞中过表达,RT-PCR检测软骨细胞特征性标志物蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)和Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ,COL2A1)的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨细胞基质分泌情况。结果小鼠脊椎生长发育过程中,Notch信号分子mRNA的表达总体呈下降趋势,其中Dll-1、Dll-3、Jag-1下降趋势尤其显著;Dll-1和Jag-1广泛表达于软骨细胞胞膜,随着小鼠年龄的增大,二者在椎间盘中的表达显著下降;BMP-2过表达可促进NP细胞成软骨分化,ACAN和COL2A1表达升高,甲苯胺蓝染色增强;Dll-1、Jag-1过表达可显著抑制BMP-2诱导的成软骨分化效应。结论 Notch信号分子,尤其是Dll-1、Jag-1对正常脊椎生长及椎间盘软骨细胞的成熟分化具有明显的负性调节作用。
- 曹光彪李明何通川毕杨罗庆罗聪何昀宿玉玺杨琼
- 关键词：NOTCH信号通路椎间盘软骨细胞骨形态发生蛋白-2重组腺病毒
- 青少年特发性脊柱侧弯血液GH、IGF-1、IGFBP-3和E2的检测被引量：5
- 2018年
- [目的]探讨青少年特发性脊柱侧弯(AIS)患儿血液生长激素(GH)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)、类胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、雌二醇(E2)的水平。[方法]118例AIS患儿,125例健康青少年作为对照。根据侧弯方向分为S型侧弯组(双向侧弯)、C型侧弯组(单向侧弯),再根据侧弯严重程度分为轻度(10°～20°)、中度(20°～40°)、重度(>40°)。采用化学发光免疫分析法检测所有研究对象血清GH、IGF-1、IGFBP-3、E2水平,并与对照组进行比较分析。[结果]S型和C型侧弯患儿血清IGF-1、IGFBP-3水平与对照组相比明显降低(P<0.05),血清GH、E2水平与对照组相比差异无统计学意义。C型侧弯的血清E2水平较S型侧弯显著增高(P<0.05)。IGF-1、IGFBP-3与Cobb's角Pearson相关分析无统计学意义。C型侧弯的中、重度组血清GH水平较轻度组显著降低(P<0.05)。C型侧弯的重度组血清E2水平较轻、中度组显著降低(P<0.05)。[结论]IGF-1、IGFBP-3水平在患儿中表达低于正常者,提示可能是AIS发病因素之一。S型侧弯和C型侧弯骨代谢存在差异。GH、E2与AIS的关系仍有待进一步研究。
- 陆干满郭绮刘星周尹毕杨瞿平李明王霞
- 血管生成素样蛋白4基因对骨肉瘤增殖及迁移作用的影响
- 2014年
- 目的应用腺病毒改良载体系统构建的携带ANGPTL4和siANGPTL4基因的重组腺病毒，通过体内外实验研究ANGPTIA基因对骨肉瘤细胞株143B增殖和迁移能力的影响。方法应用腺病毒AdEasy系统，采用同源重组法构建携带ANGPTLA和siANGPTIA基因片段的重组腺病毒Ad-ANGPTIA和Ad-siANGPTL4，有限稀释法检测病毒滴度；重组腺病毒转染143B细胞，RT-PCR检测重组腺病毒体外转染的作用，结晶紫染色法、细胞计数、划痕实验观测ANGPTIA基因对143B细胞体外增殖和迁移能力的影响；采用胫骨肿瘤细胞注射法建立裸鼠143B骨肉瘤动物模型，Xenogen生物发光成像系统动态监测骨肉瘤原位生长情况。结果成功构建携带ANGPTLA和siANGPTL4基因的重组腺病毒Ad．ANGPTLA和Ad-siANGPTL4，病毒滴度达1．2×10^11～2．6×10^11pfu／mt；根据加入的重组腺病毒携带的基因不同将实验细胞分为阴性对照组、RFP组、ANGPTL4组及siANGPTL4组，各组细胞ANGPTL4基因表达的相对强度分别为157．39±9．87、156．90±8．95、185．29±8．24、129．28±7．28，ANGPTIA组和siANGPTIA组中基因相对表达强度显著增加或降低（P〈0．05）。结晶紫染色、细胞计数及划痕实验显示，ANGPTL4基因过度表达可促进143B细胞增殖和迁移；该基因抑制后143B细胞增殖和迁移明显减缓（P〈0．05）。成功建立裸鼠143B骨肉瘤动物模型，成瘤率达100％；Xenogen生物发光成像系统动态监测发现ANGPTL4基因过度表达可促进骨肉瘤的生长；该基因抑制后肿瘤生长明显减缓（P〈0．05）。结论成功构建了Ad-AN—GPTL4和Ad-siANGPTIA重组腺病毒并感染143B细胞使其内源性表达的ANGPTL4基因增加或沉默；该基因的表达增强或沉默能促进或抑制骨肉瘤143B细胞在体内外的增殖和迁移。
- 洪思琦郭振华毕杨金先庆何通川王佚
- 关键词：骨肉瘤腺病毒
