甘宜敏
- 作品数：5 被引量：4H指数：1
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定
- 2010年
- 目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G)基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。
- 甘宜敏孔凡运史震汤仁仙郑葵阳
- 关键词：APOBEC3G克隆真核表达载体
- 应用RNA干扰抑制乙肝病毒X基因促HepG2细胞凋亡的作用被引量：2
- 2009年
- 目的:构建靶向乙肝病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并应用其体外抑制HBX促HepG2细胞凋亡的作用。方法:设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72小时后,分别以RT-PCR、Western blot和免疫荧光检测HBX的表达量。Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪检测细胞的凋亡变化。结果:重组质粒pSilencer3.1-shHBX酶切鉴定和测序结果均与设计的一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低了47.1%,进而使HBx蛋白表达量降低了58.9%,HBx蛋白荧光强度减弱,并使HBX诱导的HepG2细胞凋亡率降低了52.11%。而阴性对照质粒无此作用。结论:成功构建靶向HBXshRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,并可应用其抑制HBX促HepG2细胞凋亡的作用。
- 范宝峰刘晓梅甘宜敏史震汤仁仙郑葵阳
- 关键词：HBXRNA干扰凋亡HEPG2
- APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒(HBV)复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。
- 汤仁仙甘宜敏孔凡运尤红娟史震胡丽娜郑葵阳
- 关键词：真核表达载体HEPG2.2.15细胞
- 小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究被引量：1
- 2009年
- 目的构建靶向乙型肝炎病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础。方法设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72 h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量。结果经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3.1-shHBX与设计一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47.1%,使HBx蛋白表达量降低58.9%,而阴性对照质粒无此作用。结论成功构建靶向HBX shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达。
- 汤仁仙范宝峰刘晓梅甘宜敏史震郑葵阳
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白小发夹RNAHEPG2
- 靶向HBX基因小干扰RNA抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究
- 2010年
- 目的探讨HBX特异性RNA小干扰抑制乙型肝炎病毒复制的作用。方法用脂质体转染法将干扰质粒pSilencer3.1-shHBX和通用阴性对照质粒分别转染HepG2.2.15细胞,并设立未转染的空白对照组。分别于转染后24、487、2 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA检测3组细胞上清中HBsAg和HBeAg表达情况。结果 Western blot检测显示,干扰质粒转染组HBx蛋白表达量逐渐降低,各时间点的表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);ELISA检测显示,各时间点干扰质粒转染组细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的表达均下调,表达量与空白对照组和通用阴性对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 HBX特异性小干扰RNA可抑制HBV复制,为siRNA作为抗乙肝病毒感染制剂提供了实验依据。
- 汤仁仙孔凡运甘宜敏范宝峰尤红娟郑葵阳
- 关键词：HBX乙型肝炎病毒HEPG2.2.15细胞
