卓萌
- 作品数：8 被引量：8H指数：2
- 供职机构：上海交通大学附属第六人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市科委医学引导类科技项目上海市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞抑制转基因小鼠HBV复制被引量：3
- 2014年
- 目的 探讨经分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg18-27经CTP转导体内诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HBV转基因小鼠病毒的抑制作用. 方法 20只HBV转基因小鼠随机分组,100 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin,50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasi,50 μg CTP-HBcAg18-27及等渗盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次.流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平,微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测血清中HBsAg水平,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBVDNA水平,肝脏HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg表达.数据用均数±标准差((x-)±s)表示,用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法. 结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.70％±0.20％),其水平高于对照组50 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin (1.66％±0.53％)及50μg CTP-HBcAg18-27 (1.26％±0.56％)和空白组(0.75％±0.71％),F=741.45,P=0.000.肝脏HE染色及免疫组织化学结果显示实验组肝组织中炎性细胞的数量明显增多及HBsAg的表达显著减少,同时对小鼠血清中HBsAg及HBV DNA有明显的抑制作用. 结论 分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg 18-27经CTP转导免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量,显著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg的表达.
- 唐余燕陈小华周丽芹卓萌臧国庆汤正好余永胜
- 关键词：转基因小鼠TAPASIN
- 胞质转导肽-HBcAg_(18-27)-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用
- 2013年
- 目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法:体外分离、培养HBV转基因小鼠及近交系C57BL/6小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(interleukin,IL)-4培养5d,再加入实验组10μg/mL CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组10μg/mL CTP-HBcAg18-27、10μg/mL HBcAg18-27-Tapasin及空白组RPMI1640完全培养液.流式细胞术测定DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞仪检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.结果:体外成功诱导小鼠髓源性DC;CTP-HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达;并且CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平及诱导DC增殖T淋巴细胞增殖能力明显高于对照组及空白组[IL-12p70转基因小鼠(F=205.85,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=406.20,P=0.000)];流式细胞仪检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平也高于对照组[转基因小鼠(F=155.45,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=392.90,P=0.000)],同时HBV转基因小鼠DC表面分子及在T淋巴细胞增殖中的作用要比C57BL/6小鼠低.结论:分子伴侣Tapasin修饰胞内化抗原肽能促进HBV转基因小鼠髓源性DC的分化、成熟,并能增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及诱导CTL的产生.
- 唐余燕余永胜卓萌臧国庆汤正好陈小华
- 关键词：TAPASINT淋巴细胞
- 抗TNFα单链抗体复制缺陷型腺病毒载体的构建及表达
- 2013年
- 目的:构建pAd/CMV/V5-DEST-TNFα-scFv重组腺病毒载体,通过病毒包装、纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并对TNFα-scFv进行表达、鉴定.方法:以携带TNFα-scFv基因的载体PUC57-Amp为模板,扩增TNFα-scFv目的基因,构建穿梭质粒pDONR221-TNFα-scFv,测序证实质粒含有目的基因.与骨架质粒pAd-CMV-V5-DEST腺病毒骨架载体进行同源重组,形成表达克隆pAd/CMV/V5-DEST-TNFα-scFv.表达克隆转染293细胞,包装重组腺病毒,并鉴定和病毒滴定.结果:TNFα-scFv基因成功克隆到腺病毒载体中,转染293细胞后成功包装出重组腺病毒,病毒滴度为2.5×1011TCID50/mL,Western blot检测到TNFα-scFv基因在293细胞中高水平表达.结论:成功构建了带有TNFα-scFv基因的重组腺病毒载体,为进一步研究提供实验基础.
- 卓萌唐余燕余永胜周丽芹潘庆春王鹏臧国庆汤正好
- 关键词：肿瘤坏死因子Α
- 强制泛素化HBcAg融合基因重组慢病毒对小鼠体内细胞毒性T细胞的诱导作用被引量：1
- 2013年
- 目的观察强制泛素化HBcAg（Ub-HBcAg）融合基因重组慢病毒（Lv）对小鼠体内细胞毒性T细胞（cIL）的诱导作用。方法包装重组LV、Ub及HBcAs基因分别获得LV-HBcAg及LV-Ub-HBcAg融合基因；选取Balb／c小鼠32只，分为磷酸盐缓冲液组（PIGS组，4只，200vLPBS）、LV组（4只，200uL PBS和2×107拷贝LV的混悬液）、慢病毒HBc鲰融合基因组（LV-HBcAg组，12只，200vLPBS和2X107拷贝LV-HBcAg的混悬液）、慢病毒Ub-HBcAg融合基因组（LV-Ub-HBcAs组，12只，200t,LPBS和2X107拷贝LV-Ub-HBcAg的混悬液），所有组别的小鼠均采用尾根部皮内注射。免疫后提取小鼠T细胞，流式细胞术双标法检测胞内IFN-γ水平，ELISA法检测T细胞培养液上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平，CCK-8试剂盒检测T细胞增殖反应。结果LV-Ub-HBcAg组诱导的CTL数量高于LV-HBcAg组（t=2．30，P〈0．05）；LV-Ub-HBcAg组T细胞的增殖反应强于LV-HBcAg组（t=2．25，P〈0．05）；免疫后LV-Ub-HBcAg组分泌的IFN-γ（44．57±2．91pg／mL）和IL-2（152．77±12．39pg／mL）高于LV-HBcAg组分泌的IFN-γ（37．23±0．84pg／mL）和ID2（101．24±5．09pg／mL），差异均有统计学意义（t=2．12、2．66，P〈0．05），LV-Ub-HBcAg组和LV-HBcAg组细胞因子Ⅱ，4和IL-10分泌差异无统计学意义（t=0．83、1．00，P〉0．05）。结论LV-Ub-HBcAg能够有效刺激T细胞增殖、活化，促进Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌。抗原强制泛素化能够促进抗原蛋白的有效提呈，诱导更高水平的免疫应答。
- 周丽芹卓萌陈小华余永胜臧国庆汤正好
- 关键词：CTL泛素
- 胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin通过激活PI3K/Akt通路抑制HBV转基因小鼠特异性CTL凋亡
- 2014年
- 目的探讨胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白通过激活PI3K/Akt信号通路抑制HBV转基因小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)凋亡。方法 HBV转基因小鼠随机分组,100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin、50μg CTPHBcAg18-27-Tapasin、50μg CTP-HBcAg18-27及生理盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次。流式细胞仪检测脾细胞中胞内细胞因子水平及细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR表达的变化。结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.74±0.20)%,高于对照组50μg CTP-HBcAg-18-27-Tapasin(2.42±0.53)%及50μg CTP-HBcAg18-27(1.70±0.56)%和空白组(0.66±0.71)%(F=741.45,P=0.000);同时,100μg CTPHBcAg18-27-Tapasin融合蛋白有效抑制特异性CTL凋亡(6.29±0.02)%,低于对照组50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin(7.72±0.15)%及50μg CTP-HBcAg18-27(26.30±1.13)%和空白组(58.26±0.23)%(F=5313,P=0.000),并伴随凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR上调(F=52.61、18.32和94.18,P<0.05)。结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin能有效诱导HBV转基因小鼠特异性CTL的表达,抑制其凋亡,机制与PI3K/Akt通路的激活有关。
- 唐余燕陈小华卓萌宋琳琳汤正好臧国庆余永胜
- 关键词：P13K凋亡
- 慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定被引量：1
- 2017年
- 研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白(eGFP)及嘌呤霉素(Puromycin)抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。
- 戴胜兰卓萌汤正好臧国庆
- 关键词：慢病毒乙型肝炎核心抗原
- CTP-Ub-HBcAg原核表达载体的构建及其表达被引量：1
- 2014年
- 目的构建CTP-Ub-HBcAg原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白的表达。方法以质粒pcDNA3.1(-)-Ub-HBcAg中的Ub-HBcAg融合基因为模板设计引物,上游引物带有CTP基因序列,进行PCR扩增,PCR产物克隆到原核表达质粒pMAL-c2x中,菌落PCR阳性克隆测序鉴定,鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并进一步通过直链淀粉树脂亲和层析法纯化融合蛋白,Western blotting鉴定。结果 PCR扩增得到820 bp大小的条带,为CTP-Ub-HBcAg融合序列。该序列被克隆至表达质粒pMAL-c2x中,阳性克隆菌落测序正确,并在DE3中获得诱导表达。Western blotting鉴定为70 KD的CTP-Ub-HBcA融合蛋白。结论构建CTP-Ub-HBcAg原核表达载体并成功表达,为进一步研究该融合蛋白的功能提供了实验基础。
- 宋琳琳卓萌唐余燕陈小华余永胜汤正好臧国庆
- 关键词：CTPHBCAG融合蛋白
- 胞质转导肽介导的蛋白转导技术及其在医学领域中的应用被引量：2
- 2013年
- 胞质转导肽(CTP)是一种可携带生物活性大分子(蛋白、多肽、核酸等)转运到细胞胞质的新型转导肽.大部分CTP以及CTP融合蛋白拥有胞质定位而非细胞核定位特点.另外,CTP具有独特的器官或组织趋向性,以及高效的膜穿透能力,这些显著特点使其在感染性疾病、癌症、白血病等疾病治疗领域受到广泛关注.此文综述了CTP的分子结构、转导特点及其在医学领域中的应用.
- 卓萌臧国庆汤正好
