通过对不同裂解液配方、等电聚焦程序和SDS-PAGE方式等的对比实验,建立和优化了大弹涂鱼肝脏蛋白质组双向电泳的相关技术体系。结果显示采用裂解液中添加Tris和TBP,聚焦时适当延长除盐时间,提高聚焦电压和功率(伏-小时),能显著提高双向电泳图谱的分辨率,MSOG程序进行双向电泳(Multi-strips on One Gel MSOG),提高了双向凝胶的匹配率及有效性,降低了人为修饰点的增加,匹配率高达90%。通过相关条件优化提高了大弹涂鱼肝脏蛋白双向电泳图谱的分辨率,为后续大弹涂鱼的毒理蛋白质组学研究提供技术保障。
采用双向电泳技术,对重金属镉暴露后海洋鱼类大弹涂鱼肝脏组织的差异蛋白质进行了研究。pH=5～8、7 cm胶条电泳图谱经PDquest软件分析,结果表明,对照组、慢性胁迫组和急性胁迫组平均检测到的蛋白点数分别为512±35、509±29和532±22,匹配率约为90%,急性镉胁迫后差异蛋白点数为14个,其中7个蛋白点在胁迫后表达量显著下调,4个蛋白点显著上调,消失1个蛋白点,并新增1个蛋白点。对其中7个差异蛋白点进行肽指纹图谱分析(MALDI-TOFMS),差异蛋白分别为K18,prohibitin,GTP-binding protein Ypt1,two-componentsystem response regulator,similar to T-complex protein 1 subunit theta(TCP-1-theta)(CCT-theta),transcriptional regulator,CopG family和mitogenactivatedprotein kinase homologue。而慢性镉胁迫后差异表达点数为15个,其中8个蛋白点在胁迫后表达量显著上升,5个蛋白点显著下调,消失1个蛋白点,并新增1个蛋白点。对其中6个差异蛋白点进行肽指纹图谱分析(MALDI-TOF-MS),差异蛋白分别为GTP-binding protein Ypt1,two-component system response regulator,hypothetical protein BT-1634,keratin9,anscriptional regulator,CopG family和mitogen-activated protein kinase homologue。通过分析各蛋白的变化,探讨了慢性(0.05 mg/L,30 d)和急性(5mg/L,3 d)重金属镉胁迫的致毒机制。在急慢性镉胁迫胁迫下,不仅大弹涂鱼体内的蛋白表达发生相应的变化,鱼体内环境的动态平衡也被打破。这种变化超过大弹涂鱼的自我解毒和保护能力,就会使得肝脏细胞的正常代谢受到破坏,引起细胞凋亡。
