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甲基化特异性PCR检测FMR1和XIST基因甲基化实验方法的建立被引量：5: 2006年; 建立一种快速、灵敏的检测脆性X智障基因(fragile X mental retardation,FMR1)、X染色体失活基因(Xchromosome inactivation,XIST)甲基化的方法.用亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行脱氨基修饰.以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对:1对甲基化特异性引物和1对非甲基化特异性引物扩增FMR1基因(CGG)n重复序列区、FMR1和XIST基因的启动子区.PCR产物进一步克隆、测序.以亚硫酸氢钠和对苯二酚脱氨基修饰后的DNA为模板进行PCR扩增后的产物与预期基因目的基因片段大小相符合,无非特异性扩增产物.测序结果表明,FMR1、XIST基因中的非甲基化的C碱基转变为U碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基不改变.成功地建立了检测FMR1、XIST甲基化的方法,为实验室诊断脆性X综合征提供了新的方法.; 杨芳赵新张文红薛丽王琰白玉杰; 关键词：甲基化特异性PCR 甲基化检测

高通量apoE基因分型技术的建立及应用被引量：1: 2005年; 目的建立一种准确、快速、高通量的apoE基因分型技术。方法从外周血样品提取基因组DNA,PCR扩增覆盖第112和158密码子的apoE基因片段;构建apoE基因片段重组质粒,并进行定点诱变,以得到3种等位基因型的对照样品;PCR产物消化处理,以除去残余的引物和dNTPs;进行模板指导的荧光染料标记终止碱基的掺入反应,应用荧光偏振检测仪分析荧光偏振值的变化;检测79例阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)患者和63名健康老年人的apoE基因型,分析基因型与AD易感性之间的关系。结果对分析结果进行测序验证,表明模板指导的荧光染料标记终止碱基掺入-荧光偏振检测技术分析结果与测序结果完全相符。AD组和健康对照组样品的基因分型结果提示apoEε4等位基因是迟发型AD的危险因素。结论应用此技术进行apoE基因多态性的基因分型分析,具有准确、简易和高通量等优势,可以作为AD风险分析的一种新技术,也适于apoE基因与其他疾病相关性研究时的大规模基因筛查分析。; 张文红白玉杰王琰李丁阎小君; 关键词：APOE基因分型技术基因分型荧光偏振等位基因型高通量

血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞表达上调基因的分离和鉴定被引量：5: 2005年; 为了对成年大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF)受血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析,以受Ang Ⅱ刺激CF为实验方,未刺激CF为驱动方,进行抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),建立消减cDNA文库。经斑点杂交筛选文库后将表达变化显著的部分阳性克隆测序及同源性分析,共获得19个上调表达的基因,分别与细胞外基质、细胞周期、胞内信号转导、细胞骨架及细胞代谢等功能相关,并克隆到7个新的基因表达序列标签(expressed sequence tags,EST)。我们的数据证实了SSH可以有效地克隆成年大鼠CF受Ang Ⅱ 刺激后上调表达基因,对这些基因的研究将有助于阐明心肌重塑的分子机制。; 王新凤高广道杨予白周娟王亚文苏兴利王琰韩锋产白玉杰; 关键词：成纤维细胞抑制消减杂交

高通量测定技术检测结核分枝杆菌耐利福平的研究被引量：8: 2005年; 目的基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术,建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法,并探讨其临床应用价值。方法设计一对聚合酶链反应(PCR)引物,其中一引物经生物素化修饰,PCR扩增含耐药决定区一297bp长的rpoB基因片段,借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物。设计2个正向测序引物,运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定。通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析,评价所建立方法的检测敏感性。通过对已知耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株进行分析,评价所建立方法的检测特异性。结果PCR扩增后,可在2h内得到耐药决定区序列。所建立方法的检测灵敏度为50fgDNA/反应。在所分析的利福平敏感株中均未检测到耐药决定区突变,而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变。结论所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于对耐利福平结核分枝杆菌进行快速高通量检测。; 赵锦荣白玉杰王琰张庆华罗明闫小君; 关键词：高通量耐利福平结核分枝杆菌 PCR产物 H37RV RPOB 链亲和素

NDRG2蛋白的毕赤酵母可溶表达与纯化被引量：1: 2003年; 目的 :酵母表达并纯化可溶性NDRG2蛋白 .方法 :从 pRSET A ndrg2重组质粒中扩增出 6his ndrg2融合基因 ,克隆入酵母表达载体 pPIC3.5K ;酵母重组表达载体pPIC3.5K 6his ndrg2电转化入毕赤酵母GS115 ,并进行营养缺陷筛选和G4 18抗性筛选 ;对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达 ,可溶性表达产物经Ni NTA亲合层析纯化 .结果 :构建得到酵母融合重组表达载体 pPIC3.5K 6his ndrg2 ;经G4 18浓度梯度筛选得到串联整合 16个重组表达载体以上的重组酵母表达菌株 ;诱导后表达得到 6his NDRG2融合蛋白 ,并成功纯化得到可溶性表达产物 .结论 :表达并纯化得到可溶性NDRG2蛋白 ,为进一步研究NDRG2的结构与功能打下了必要的基础 .; 张文红刘新平王琰韩月恒药立波; 关键词：毕赤酵母基因表达

利用荧光偏振技术检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG315点突变被引量：12: 2004年; 目的　应用模板指导的荧光染料终止物掺入反应荧光偏振检测技术 (template directeddye terminatorincorporationwithfluorescencepolarizationdetection ,TDI FP)分析结核分枝杆菌KatG 315点突变与异烟肼耐药性的关系 ,并建立一种准确、快速的诊断结核分枝杆菌异烟肼耐药性的新方法。方法　对临床 82例耐多药结核病患者所感染的结核分枝杆菌菌株进行常规培养和药敏实验 ;提取结核分枝杆菌DNA ,并经聚合酶链反应 (PCR)扩增 2 71bp的KatG基因片段 ,PCR产物经消化处理清除残余dNTPs和引物 ,进行TDI反应 ,应用Victor2测定荧光偏振值 ,分析所有样品的KatG基因 315位点的基因型。结果　 2 9例异烟肼高度耐药患者的结核分枝杆菌中有 15例发生KatG 315的G→C突变 ,其中 4例为KatG 315突变和未突变的混合感染 ,突变率为 5 2 % ;32例异烟肼低度耐药患者的结核分枝杆菌中有 15例为KatG 315突变和未突变的混合感染 ,突变率为 4 7% ;2 1例异烟肼敏感患者的结核分枝杆菌未发现KatG 315突变。结论　KatG 315突变与结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药性密切相关 ;应用TDI FP技术检测KatG 315突变具有准确、快速、简便以及高通量等优点。; 王琰张文红赵锦荣罗明张增贤白玉杰阎小君; 关键词：药物耐受性

CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化被引量：1: 2007年; 目的:对人CGGBP1蛋白进行原核表达及纯化,为进一步研究CGGBP1的生物功能奠定基础.方法:构建原核表达载体pRSETA/CGGBP1.在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBP1蛋白,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结果:诱导后表达得到CGGBP1蛋白,纯化得到的可溶性表达产物CGGBP1蛋白可以和d(CGG)29重复序列双链DNA特异性结合.结论:表达并纯化得到可溶性CGGBP1蛋白,为进一步研究CGGBP1的结构与功能奠定了必要的基础.; 杨芳张文红薛莉王琰夏琳白玉杰; 关键词：基因表达纯化

用单表位合成肽抗原荧光偏振免疫法检测抗幽门螺旋杆菌尿素酶的抗体被引量：3: 2005年; 目的:应用单表位合成肽抗原,建立一种新的基于荧光偏振技术(fluorescencepolarization,FP)的抗体检测方法。方法:用幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreB)的单表位合成分支肽抗原免疫小鼠,以ELISA法分析免疫的效果。分析FITC标记的合成肽抗原在不同浓度时的FP值,用FP技术分析抗原表位的抗原性以及不同稀释比例的血清样品对FP检测的影响。分别应用FPIA法和ELISA法,对126例样品进行Hp感染检测,对FPIA的检测数据进行受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)分析。结果:UreB的单表位抗原肽具有较强的抗原性和免疫原性;1.0nmol/L的FITC标记肽可用于FPIA检测,血清样品做1∶25稀释时可明显区分阳性和阴性检测结果。与ELISA方法检测的结果相比较,用基于UreB单表位合成肽抗原的FPIA法检测Hp感染的灵敏度为85.7%,特异度为98%。结论:应用UreB单表位合成肽抗原,可对抗UreB的抗体进行快速FPIA检测,用此法检测抗体在疾病的临床诊断中具有广阔的应用前景。; 张文红王琰郭慧芳白玉杰阎小君; 关键词：合成肽荧光偏振幽门螺旋杆菌尿素酶B

淋球菌基因诊断新进展被引量：2: 2005年; 淋球菌是一类寄生于人体尿道黏膜,导致人类泌尿生殖系感染的的细菌。及时、准确地诊断淋球菌感染是控制淋病传染的关键。基因检测技术在淋球菌临床诊断中的应用将使淋球菌的检测更加灵敏、准确。本文就近年来应用于淋球菌临床诊断的目的基因和新的检测技术以及它们在临床诊断中的特异性和敏感性综述如下。; 罗进王琰张菊阎小君; 关键词：奈瑟球菌淋病基因

Ndrg2基因及NDRG2蛋白的生物信息学分析被引量：16: 2003年; 目的 :对ndrg2 (n mycdownsreamregulatorgene 2 )基因调控区和NDRG2蛋白序列进行生物信息学分析 ,从结构上预测其功能 .方法 :运用internet网络上的数据库及程序 ,对ndrg2基因的调控区和NDRG2蛋白的二级结构进行生物信息学分析 .结果 :ndrg2基因调控区存在多种转录因子结合位点 ,功能主要涉及组织特异性表达调控 ,细胞生长发育相关基因和应激反应基因的表达调控等 ;NDRG2蛋白的结构属于α/β水解酶类折叠 ,其分类预测表明与细菌环氧化物水解酶的二级结构极为相似 .结论 :生物信息学分析提示NDRG2蛋白具有一定的酶活性 ,可能参与细胞抗氧化应激反应 ,内外源有毒物质的代谢。; 张文红刘新平王琰韩月恒药立波; 关键词：NDRG2基因生物信息学分析

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王琰

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