云涛 作品数:128 被引量:265 H指数:7 供职机构: 浙江省农业科学院 更多>> 发文基金: 浙江省自然科学基金 国家自然科学基金 浙江省重大科技专项基金 更多>> 相关领域: 农业科学 生物学 医药卫生 环境科学与工程 更多>>
共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定 被引量:8 2012年 为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。 邓晓辉 陈柳 叶伟成 李军星 崔尚金 余斌 云涛 崔言顺 孙元 仇华吉 张帅 张存关键词:细菌人工染色体 猪细小病毒 猪圆环病毒2型 猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法 本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征二价重组腺病毒疫苗及其制备方法,属于生物疫苗制备技术领域。该疫苗可通过在PRRSV GP5和M蛋白之间插入一具有自我裂解的FMDV 2A基因相连接,构建成GP5-2A-M融合蛋白基因,并与腺... 刘光清 云涛 倪征 余斌 陈柳 华炯钢 李双茂文献传递 鸭源禽副黏病毒1型YH_(99) V株的毒力测定和致病特性分析 2007年 从浙江省某麻鸭养殖基地的产蛋下降病鸭生殖器官内分离到1株致产蛋锐减、不致鸭死亡的病毒,经鉴定该病毒属于禽副黏病毒1型,命名为YH99V株。该毒株经动物回归试验能成功诱导鸭发病并回收同样的病毒,通过SPF鸡胚盲传至第9代时致病性突然增强,第11代出现血凝特性,第15代血凝价趋于稳定,鸡胚半数致死量EF15ELD50为10-4.8。MDT、ICPI和IVPI毒力学指标测定以及毒力相关基因序列结构分析表明,分离株的MDT为112h,ICPI为0.225,IVPI为0.41;YH99 V株F0蛋白裂解位点(112~117位)区域氨基酸推导序列为Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu,与弱毒株相一致。证明该毒株为新城疫弱毒株。 何永强 梁华丽 华炯钢 云涛 倪征 李双茂关键词:毒力 致病特性 番鸭呼肠孤病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法 本发明公开了一种番鸭呼肠孤病毒通用型RT-PCR检测引物及检测方法,属于鸭类病毒检测技术领域。该通用型RT-PCR检测引物为上游引物:5’-CACAGTGCTACCATC-3’,下游引物:5’-CTGCTGATCATAA... 叶伟成 余斌 张存 云涛 陈柳 倪征 华炯钢文献传递 表达小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用 本发明公开了一种表达小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用,该重组鸭瘟病毒的基因组中插入有小鹅瘟病毒VP2基因,所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述构建方法包括:(1)将pDE... 陈柳 张存 倪征 叶伟成 余斌 云涛 华炯钢文献传递 鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用 被引量:6 2014年 为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku.Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法.采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件.重组抗原最适包被浓度为5 μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑.该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4% ~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性.用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%. 余斌 华炯钢 刘跃生 赵灵燕 倪征 叶伟成 云涛 陈柳 徐辉 张存关键词:间接酶联免疫吸附试验 DEV囊膜糖蛋白gI基因缺失病毒生物学特性研究 被引量:2 2014年 在构建鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体感染性克隆pDEV-vac的基础上,通过两步Red E/T重组,构建了gI基因缺失的pDEV-ΔgI突变体克隆,并转染鸡胚成纤维细胞获得了重组病毒rDEV-ΔgI。病毒生长曲线显示,rDEV-ΔgI的滴度从12 h到60 h稳步增加,在此期间gI基因缺失毒株病毒滴度较亲本毒株稍有降低,但病毒滴度于72 h接近并超过对照毒株。蚀斑面积测定发现rDEV-ΔgI较亲本毒rDEV-BAC增加约60%。动物实验表明,rDEV-ΔgI注射组对强毒攻击的保护率较对照组下降40%。研究表明:gI为DEV的非必需基因,且gI基因与病毒扩散、免疫保护能力等相关。 陈柳 余斌 倪征 华炯钢 叶伟成 云涛 张存关键词:鸭瘟病毒 GI 兔出血症病毒在体外诱导细胞凋亡 2009年 The apoptosis of RK13 cells induced by RHDV was investigated with DAPI staining,DNA ladder,Caspase 3 activity and flow cytometry,etc.The results showed that nuclear staining of infected cells with DAPI showed gradually morphological changes of the nuclei.As shown in the paper,a canonic oligonucleosome-sized DNA ladder was observed in cells harvested at 24h,48h and 72h post-infection,confirming that DNA fragmentation was induced by RHDV infection.The results of flow cytometry showed that about 63 % of cells were in apoptosis at 48h post-infection.Besides,we also demonstrated that the activation of Caspase 3 occurred during the infection process.In conclusion,our results showed that apoptosis in RHD might be determinant in the development of the pathogenesis of RHD. 倪征 魏威 刘光清 陈柳 余斌 云涛 华炯钢 李双茂关键词:兔出血症病毒 凋亡 CASPASE-3 慢病毒介导的稳定表达鸭干扰素-γ细胞株的构建 2024年 干扰素-γ是一种具有抗病毒活性和免疫调节能力的细胞因子之一。为了建立稳定表达鸭干扰素-γ(duIFN-γ)的细胞系,本研究优化并合成了duIFN-γ基因,插入到慢病毒表达载体plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro,获得重组质粒plenti-IFN,将plenti-IFN与辅助质粒共转染包装细胞293T,筛选出了携带duIFN-γ基因的重组慢病毒rlenti-IFN,将该病毒感染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,利用有限稀释法和抗性加压筛选法,筛选出了30个具有嘌呤霉素抗性基因的单克隆细胞系。利用RT-qPCR荧光定量法对这些单克隆细胞的duIFN-γ mRNA水平进行检测,筛选出了duIFN-γ mRNA水平最高的1个单克隆细胞,对其进行扩大培养,获得了1株稳定细胞系。Western blot检测结果表明,duIFN-γ稳定表达于该细胞系中。本研究获得了1株稳定表达duIFN-γ蛋白的细胞系,该研究为开展duIFN-γ生物学功能研究、建立duIFN-γ检测方法及生产廉价鸭(禽)用干扰素奠定了基础。 陈柳 倪征 刘可姝 叶伟成 华炯钢 云涛 朱寅初 张存关键词:慢病毒 CHO细胞 鸭新病原坦布苏病毒的发现及致病特征与检测新技术 张存 云涛 张大丙 余斌 叶伟成 周彩琴 李剑秋 陈柳 倪征 华炯钢 徐辉 吴赟竑 张传亮 吴雪军 研究成果在国际上首次发现了鸭的一种新病原坦布苏病毒,明确了其分类地位、病毒特性和致病性;建立了鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR检测方法和实时定量RT-PCR检测方法;研制了鸡、鸭和鹅IgG通用型单克隆抗体,建立了家禽通用型...关键词:关键词:流行病学调查