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乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析被引量：6: 2007年; 目的确定乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶末端蛋白(terminal protein,TP)抗α-干扰素(IFN-α)的功能区域。方法PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中,构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激,ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的表达,建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准。构建TP(包括Spacer区)基因缺失突变体重组真核表达载体,通过融合表达的多肽表位抗体,Western blot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达。重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞,转染后48 h给予终浓度为100 IU/ml的IFN-α2a刺激,作用24 h后裂解细胞,通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用,并据此确定TP(包括Spacer区)抗IFN-α作用的功能区域。结果获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强,且在IFN-α2a终浓度为100 IU/ml时达到最大。West- ern blot显示TP(包括Spacer区)各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白。共转染p6-16CAT及部分/全长TP的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下,胞内CAT值和对照组相比无显著差别,相反,全长TP+部分/全长Spacer使细胞内CAT值显著下降。结论DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关。; 王林柏世玉陈婉南李晖林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 Α-干扰素 DNA聚合酶

乙型肝炎病毒对HepG2细胞影响的蛋白质组学分析被引量：1: 2007年; HBV可引起急慢性肝炎、肝硬化，并与原发性肝细胞癌发生、发展关系密切。近年来，尽管HBV编码蛋白，如S蛋白、表面抗原大蛋白等，致肝细胞病变作用得到广泛重视，但HBV对宿主细胞的整体影响尚鲜见报道。本研究采用蛋白质组学相关技术，即差异凝胶电泳（differentialin—gel electrophoresis）和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI—TOF-TOFMS）技术，整体研究HBV对HepG2细胞蛋白表达的影响，鉴定其中的差异蛋白质，为更合理地探讨HBV对细胞功能的影响提供理论依据。; 黄清玲柏世玉林建银林旭; 关键词：HEPG2细胞乙型肝炎病毒蛋白质组学急慢性肝炎

双剪接型2·2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白可反式激活GAL4反应元件被引量：1: 2006年; 为研究双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白—yTPds的功能,以酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7克隆yTPds基因并转化酵母细胞AH109获得相应重组子,滤纸法及液相分析法测酵母转化子内β-半乳糖苷酶(-βgal)的活性,证实yTPds蛋白可反式激活酵母GAL4反应元件(GAL4 responsive ele-ment)。在此基础上,为进一步探讨该蛋白反式激活作用的功能区域,以pGBKT7分段克隆yTPds基因,分别编码yTPds蛋白N端47个氨基酸(yTPds-N47)、N端75个氨基酸(yTPds-N75)、中部28个氨基酸(yTPds-M28)、C端92个氨基酸(yTPds-C92)、C端64个氨基酸(yTPds-C64)以及去除中部28个氨基酸的融合蛋白(yTPds-Fusion)。各重组载体转化酵母细胞AH109获得相应转化子。滤纸法定性检测酵母转化子内-βgal活性,结果显示yTPds-N75、yTPds-M28、yTPds-C92蛋白可反式激活GAL4反应元件,液相分析法显示酵母转化子内-βgal活性强弱为yTPds-M28>yTPds-N75>yTPds-C92>yTPds,提示yTPds蛋白反式激活作用的功能区域是其中部28个氨基酸,该区域对应于HBV preS1蛋白反式激活功能域。此研究证实双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白具有反式激活作用,提示其可能具有重要的致病意义。; 陈婉南郭丹华柏世玉王林林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒 RNA剪接反式激活 GALA 反应元件

乙型肝炎病毒X蛋白对MMPs及TIMPs的影响: 2007年; 目的全面分析乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)对基质金属蛋白酶(Matrix Metallo-proteinases,MMPs)及组织金属蛋白酶抑制物(Tissue Inhibitors of Metalloproteinases,TIMPs)的影响,探讨其在肝细胞癌的侵袭转移中的可能作用。方法PCR扩增HBVX基因并克隆入真核表达载体pcDNA3.1/HisC,重组载体及空载体分别以Lipofectamine2000转染HepG2细胞并以800μg/mlG418筛选抗性细胞克隆。以Western blot检测抗性细胞HBx表达。抽提细胞总RNA,半定量RT-PCR检测MMPs及TIMPs。收集细胞培养液上清,以明胶酶谱检测MMP2及MMP9活性,反相明胶酶谱检测TIMPs活性。结果构建了HBx重组载体pcDNA3.1-XB。该重组载体及对照空载体转染HepG2细胞后,G418筛选,分别获得抗性细胞克隆HepG2-XB及HepG2-HIS,前者经Western blot证实可表达HBx。半定量RT-PCR显示HBx可促进MMP2、7、13、14、16、17、19、23、24及TIMP1、4基因的转录,抑制MMP1、3、8、9、10、11、12、15、20及TIMP2、3基因的转录。明胶酶谱检测显示HBx可促进酶原MMP2(Pro-MMP2)及活性MMP9(Active-MMP9)表达,抑制酶原MMP9(Pro-MMP9)表达;反相明胶酶谱显示HBx可促进TIMP1、TIMP4的表达,同时抑制TIMP2及糖基化TIMP3的表达。结论HBx蛋白对MMPs、TIMPs转录表达的影响是多方面的,但这种影响在HBx促进肝癌细胞侵袭转移过程中的确切机制有待进一步阐明。; 柏世玉黄清玲李晖王林郑瑾林建银林旭; 关键词：乙型肝炎病毒基质金属蛋白酶组织金属蛋白酶抑制物

乙型肝炎病毒X蛋白对MMPs及TIMPs表达的影响: 肝癌/(Hepatocellular Carcinoma,HCC/)的侵袭转移与基质金属蛋白酶/(Matrix Metalloproteinases,MMPs/)密切相关。研究表明,乙型肝炎病毒X蛋白/(hepatiti...; 柏世玉; 关键词：乙型肝炎病毒 HBX蛋白 MMPS TIMPS; 文献传递

乙型肝炎病毒细胞株HepG2－RHBV的构建: 本发明公开了一种乙型肝炎病毒细胞株HepG2－RHBV的构建，属人体疾病的预防与治疗的前期研究。本发明构建能稳定表达HBV相关抗原并复制的HepG2细胞株，作为模板的HBV DNA以重组DNA方式游离于细胞染色体外；以H...; 林旭黄清玲柏世玉林建银; 文献传递

乙型肝炎病毒在HepG2细胞中的稳定复制及表达: 2007年; 目的建立HBV HepG2肝细胞株,使HBV能长期稳定地表达抗原并复制。方法将含完整转录单位的1.2倍体HBV DNA经Sal (?)位点克隆入真核表达载体pREP10,构建的重组载体pREP-HBV以Lipofectamine2000转染HepG2细胞,250μg/mL潮霉素筛选抗性细胞克隆。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg。电子显微镜下观察细胞上清液HBV颗粒。制备HBV特异性探针,以Southern印迹法检测细胞株内HBV核心颗粒DNA。结果获得含1.2倍体HBV DNA的重组载体,即pREP-HBV,该重组载体转染HepG2细胞后,获得5株潮霉素抗性细胞RHBV1～RHBV5,均能表达HBsAg和HBeAg。Southern印迹结果显示各株细胞均可见明显的杂交拖带,即存在HBV DNA复制中间体。细胞培养上清液浓缩后在电子显微镜下可见成簇的、直径约42 nm的HBV颗粒及直径为22～26 nm的球形颗粒。结论成功建立了HBV稳定复制及表达的HepG2细胞株,目前细胞已传代50次,每3天1次。; 黄清玲柏世玉王林陈婉南林建银林旭; 关键词：转染病毒复制

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柏世玉

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