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Urinary Stone Analysis with Fourier Transform Infrared Spectroscopy (520Cases): Urinary stone analysis is important technology in determining the possible etiology and the pathophysiology of...; 艾丽娅; 文献传递

Urinary Stone Analysis with Fourier Transform Infrared Spectroscopy (520Cases): Urinary stone analysis is important technology in determining thepossible etiology and the pathophysiology of ...; 艾丽娅

产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定: 2012年; 目的构建尉人肠道米源产甲酸草酸杆菌（OxCF）甲酰辅酶A转移酶（FCoAT）基因（FRC）和草酰辅酶A脱羧酶（OCoAD）基因（OXC）的重组慢病毒pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED，为高草酸尿症的基因治疗奠定基础。方法采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段，用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收，用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-TSimple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆并测序，筛选携带完整目的基因质粒pMD18Tsimple—FRC和pMD18Tsimple—OXC，用BamHI酶切获得目的基因，连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6．3／v5DEST—IRES—EGFP，连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6．3／v5DEST—IRES—DsRED，转化DH5a后挑取阳性克隆并测序。构建的慢病毒过表达载体pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED转染ttEK293T细胞，包装并测滴度。结果聚合酶链反应（PCR）从OxCF基因组中扩增分获得1．3kh和1．7kh的DNA片段，与Genbank中FRC（U82167）间碱基序列匹配率为95．88％，存在53个碱基的变异；与Genbank中OXC（M77128）间碱基序列匹配率为93．61％，存在109个碱基的变异；测序证实pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED分别含有大小正确的正向FRCcDNA和OXCcDNA，转染ttEK293T细胞实验24h后，在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光，两种慢病毒滴度分别为1．15×10^8TU／ml和9．75×10^7TU／ml。结论成功构建表达OxCF中草酸分解关键基闵FRC和OXC的重组慢病毒载体，并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒。; 杨欢陈志强叶章群王博涵艾丽娅姚炜敏; 关键词：慢病毒载体高草酸尿症

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艾丽娅

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