卢小玲
- 作品数：11 被引量：27H指数：3
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 原核表达、体外折叠的HLA-G5促进人外周血单核细胞产生TNF
- 2006年
- 通过原核表达获得HLA-G5重链和轻链(β2m),经初步纯化后,利用稀释法与人工合成的九肽(KGPPAALTL)一起进行体外复性折叠,形成HLA-G5-抗原肽复合物,经非变性PAGE/Western blot和夹心ELISA法鉴定,证实复性后成功获得天然构象的HLA-G5。利用PBMC受LPS刺激后产生TNF的特点,观察原核表达、体外折叠的HLA-G5对人PBMC分泌TNF的影响。TNF分泌量采用TNF敏感的L929细胞进行生物法测定,结果显示原核表达、体外折叠的HLA-G5促进人PBMC分泌TNF-α。
- 褚利霞吴雄文夏芳珍鈡茂华李青翁秀芳卢小玲张彩娥陆盛军梁智辉龚非力
- 关键词：稀释复性TNF
- 生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备被引量：3
- 2006年
- 目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。
- 卢小玲吴雄文翁秀芳李青梁智辉龚非力
- 关键词：生物素化
- 加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定被引量：1
- 2006年
- 目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。
- 张彩娥邓云华吴雄文梁智辉翁秀芳卢小玲夏芳珍钟茂华陆盛军
- 关键词：HLA-A2尖锐湿疣细胞毒性T细胞
- 可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化
- 2006年
- 目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠,形成HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体,并在BirA酶的作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-pBRLF1复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗(W6/32和兔抗人β2m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA-A*2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞(aAPCs)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA-A*2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA-A*2402-pBRLF1四聚体。结论HLA-A*2402-pBRLF1四聚体构建成功,为特异性CTL的检测提供了有力的工具。
- 卢小玲吴雄文翁秀芳李青梁智辉龚非力
- 关键词：生物素化四聚体
- 可溶性HLA-G1-肽复合物的体外折叠和鉴定被引量：2
- 2006年
- 目的合成可溶性HLA-G1-肽复合物。方法利用原核高效表达的可溶性HLA-G1重链和轻链(β2m),在人工合成的HLA-G1限制性九肽(KGPPAALTL)存在的条件下,通过稀释复性折叠成可溶性HLA-G1-肽复合物。利用特异性抗体(W6/32及兔抗人β2m抗体)进行免疫印迹及酶联免疫吸附试验,检测稀释复性的折叠产物。结果折叠复合物含有35%可溶性HLA-G1-肽复合物、5%可溶性HLA-G1重链聚合体及60%复性的β2m3种成分。结论通过原核表达、体外折叠能够获得大量可溶性HLA-G1-肽复合物。
- 夏芳珍吴雄文钟茂华褚利霞翁秀芳张彩娥卢小玲梁智辉
- 关键词：MHCI类可溶性稀释复性
- HGPRT缺陷型T淋巴瘤细胞系的建立与鉴定被引量：4
- 2006年
- 目的通过突变诱导次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型的T淋巴瘤细胞系,为制备T细胞杂交瘤提供利于筛选的亲代细胞。方法通过乙基甲磺酸对Jurkat细胞进行突变,逐步提高培养液中6-巯基鸟嘌呤(6-TG)的浓度,筛选出对6-TG具有稳定抗性的单克隆细胞株Jur16-TG细胞。比较Jurkat细胞与Jur16-TG细胞在含6-TG培养液和HAT培养液中的生长情况。结果在含20μg/ml 6-TG的培养液中,Jur16-TG细胞能够稳定生长,而Jurkat细胞在培养1周后基本死亡。在HAT培养液中氨基喋呤的浓度为4×10-8mol/L或8×10-8mol/L时,Jur16-TG细胞4 d内基本死亡,而Jurkat细胞至少能存活7~10 d。Jur16-TG细胞与正常外周血淋巴细胞(PBL)的融合实验显示,35%的Jur16-TG细胞与PBL融合。结论突变筛选出的单克隆细胞株Jur16-TG具有6-TG抗性和在HAT培养液中不能生长的特性,证实该细胞为HGPRT缺陷型细胞株,并且该细胞株可有效地与原代淋巴细胞融合,从而为T细胞杂交瘤的制备提供了利于筛选的亲代永生化的T细胞。
- 翁秀芳吴雄文梁智辉陆盛军卢小玲张彩娥钟茂华陈雪玲龚非力
- 人工抗原提呈细胞的制备和应用的研究
- 2006年
- 目的制备人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cell,aAPC)并用它从HLA-A2阳性健康个体外周血单个核细胞(PBMC)中诱导和扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法将HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子吸附固定在细胞大小的聚苯乙烯乳胶微球(5μm)表面制成aAPC；采用流式细胞仪表型分析；aAPC和HLA-A2阳性个体人外周血单核细胞进行混合淋巴细胞反应；用HLA-A*0201-EBV四聚体染色法检测特异性CTL的频率；应用细胞内细胞因子染色法检测特异性CTL功能性细胞因子IFN-γ的分泌；采用LDH释放法检测特异性CTL的特异杀伤活性。结果流式细胞仪分析显示微球表面吸附有HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子；四聚体检测及细胞内细胞因子染色法检测与经典细胞毒试验结果一致,结果表明aAPC在体外可诱导抗原特异性CTL的生成。结论aAPC制备成功,并在体外有效地诱导抗原特异性CTL的生成。
- 梁智辉卢小玲吴雄文翁秀芳张彩娥陆盛军夏芳珍龚非力
- 关键词：细胞毒性T淋巴细胞四聚体
- sHLA-A*2402融合蛋白的制备与特性研究被引量：4
- 2005年
- 本文用含有HLA-A*2402重链胞外段基因的质粒为模板进行PCR,利用下游引物拼接上依赖BirA的可生物化序列后,构建融合基因sHLA-A*2402-BSP,与质粒pET-21d重组后,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达的融合蛋白与β2m及HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行复性折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并用Westernblot和夹心ELISA法鉴定。证实成功地制备出sHLA-A*2402-生物素化序列融合蛋白并使之正确折叠复性。为研究在原核系统中表达、纯化与复性及体外构建MHCI类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础。
- 卢小玲吴雄文翁秀芳梁智辉李青龚非力
- 关键词：稀释复性
- 自身肽结合于HLA-A2分子上能够在体外诱导抗原肽特异性的同种T细胞被引量：1
- 2007年
- 在同种反应性T细胞(同种T细胞)识别的配体中,抗原肽的作用是免疫学长期争论的问题,即同种T细胞识别是否具有抗原肽特异性.为了证实通过长期混合淋巴细胞培养(LTMLC)方法能够诱生抗原肽/MHC复合物(pMHC)特异性的同种T细胞,本研究利用仅表达HLA-A2,TAP缺陷的T2细胞,将酪氨酸激酶来源的自身抗原肽(Tyr369-377)和EB病毒来源的病毒抗原肽(LMP2A426-434)分别加载到T2细胞上,使T2细胞提呈单一的T细胞抗原识别表位,并且选择4个HLA-A2阳性(HLA-A2+ve)与4个HLA-A2阴性(HLA-A2-ve)个体的PBL样本,与加载上述抗原肽的T2细胞混合培养.在此实验系统中,HLA-A2+ve PBL与加载病毒抗原肽的T2细胞(T2/LMP)混合培养代表T细胞对普通抗原的反应,而HLA-A2-ve PBL与加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)混合培养则为T细胞对同种抗原的反应.利用特异性pMHC四聚体染色与特异性细胞毒试验检测LTMLC诱生CTL的特异性,其中利用HIV抗原肽(Gag77-85)作为对照.结果显示:(ⅰ)T2/LMP与HLA-A2+ve个体的PBL混合培养产生CTL(CTL-T2/LMP),CTL-T2/LMP对T2/LMP的杀伤显著高于对照T2/HIV的杀伤(26.52%±3.72%vs7.01%±0.87%,P<0.001);LMP四聚体对CTL-T2/LMP染色的阳性细胞数显著高于对照HIV四聚体(0.98%±0.33%vs0.05%±0.01%,P=0.0014);(ⅱ)加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)可诱导HLA-A2-ve个体的PBL产生CTL(CTL-T2/Tyr),CTL-T2/Tyr对T2/Tyr的杀伤显著高于对T2/HIV的杀伤(28.07%±2.58%vs6.87±1.01%,P<0.001);Tyr四聚体对CTL-T2/Tyr染色的阳性细胞数显著高于HIV四聚体(0.88%±0.3%vs0.06±0.03%,P=0.0018).结果说明:结合于自身MHC分子上的病毒抗原肽与结合于同种MHC分子上的自身抗原肽都能诱导产生抗原肽特异性的CTL;在LTMLC诱生的同种CTL中,有相当数量的CTL具有pMHC特异性,这些同种CTL的识别机制与普通抗原反应性CTL一样,识别的对象也是特异性的pMHC.支持了同种抗原的pMHC种类繁多造成同种T细胞反应强度极高的假说.�
- 翁秀芳梁智辉卢小玲钟茂华陆盛军张彩娥邓靖吴雄文龚非力
- 细胞膜染料PKH26在淋巴细胞及其亚群增殖中的应用
- 2006年
- 目的探讨细胞膜染料PKH26在淋巴细胞及其亚群增殖中的应用。方法利用PKH26染色、荧光抗体标记和流式细胞术,检测淋巴细胞及其亚群在多克隆刺激剂刺激作用下荧光强度的变化,应用相关软件分析其增殖情况,并与传统MTT方法进行比较。结果经不同浓度的多克隆刺激剂刀豆蛋白A(ConA)刺激72h后,两种方法均能检测淋巴细胞增殖情况,其增殖强度与刺激剂浓度呈正相关(r=0.999)。经同种细胞刺激6d后,结合CD8、CD3抗体染色,经ModFit软件拟合后,PKH26能显示的T细胞亚群与T淋巴细胞明显不同的细胞增殖动力。结论PKH26染色结合荧光抗体标记和流式细胞术,是分析淋巴细胞及其亚群增殖动力的有力工具。
- 梁智辉卢小玲吴雄文
- 关键词：淋巴细胞PKH26增殖
