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肝细胞生长因子基因转染大鼠急性脑卒中模型的生物效应被引量：1: 2007年; 目的探讨肝细胞生长因子(HGF)基因转染大鼠急性脑卒中模型后的表达情况及其生物学效应。方法 39只实验用大鼠,线栓法制备成可控性急性大鼠脑卒中模型。利用基因重组技术将 HGF 基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因标记的真核表达载体 PIRES2-EGFP 进行融合,构建真核细胞表达质粒。通过脂质体介导法,立体定向下多点注射到大鼠急性脑卒中模型的缺血半暗带区域行基因转染,转染7 d 后断头取大鼠脑组织,切片观察 HGF 基因在大鼠脑内的表达情况;并采用兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体对大鼠脑组织进行免疫组化染色,显微镜下随机检测5个高倍视野下缺血半暗带区血管数量;同时在基因转染前及转染后7 d,应用 CT 灌注扫描对实验鼠脑血流量进行监测,观察基因转染对脑血流量的影响。将大鼠脑卒中模型随机分成3组(每组13只):(1)注射脂质体/pIRES2-EGFP-HGF 质粒的实验组;(2)注射脂质体/PIRES2-EGFP 空载质粒的空载体对照组;(3)空白对照组(未进行注射)。结果酶切鉴定及基因测序证实,HGF 基因片段已克隆到PIRES2-EGFP 的 BamH I 和 Sal I 位点之间。HGF 基因转染大鼠缺血半暗带区7 d 后,利用荧光显微镜观察可见到绿色荧光蛋白的表达,用免疫组化方法进一步让实了 HGF 的表达。实验组大鼠转染局部血管数量(46.71±7.11)条/5个高倍视野,明显多于对照组的(20.43±3.21)条/5个高倍视野和空白对照组的(18.00±3.27)条/5个高倍视野(F=74.447;P<0.01);CT 灌注显示其梗死侧大脑半球的脑血流量(63.82±6.08)%也高于对照组(53.58±4.19)%和空白对照组(52.46±4.93)%(F=10.445;P<0.01)。结论脂质体转染 HGF 基因能够在缺血半暗带区表达,表达产物能够发挥生物学效应,促进局部血管侧支循环形成。; 张晓波金征宇李明利王任直李桂林孔燕国王建明高山关鸿志王德田罗玉凤; 关键词：肝细胞生长因子脑缺血转基因

低氧启动重组腺相关病毒的构建: 2005年; 目的构建低氧启动rAAV,介导目的基因仅在低氧时特异性高效表达。方法通过分子生物学的方法,分别构建pGL3-6 HRE-CMV-mp和pGL3-6 HRE-CMV-mp-WPRE载体,比较2种低氧启动子的特异性和在低氧时的启动能力。选择最佳的低氧启动子构建低氧启动rAAV载体。采用磷酸钙和氯仿-PEG8000/NaCl-氯仿法构建低氧启动rAAV病毒。rAAV病毒蛋白电泳和EGFP报告基因验证低氧启动rAAV病毒的构建和介导目的基因在低氧时的表达。结果HRE-CMV-mp- WPRE是最佳的低氧启动子,在低氧时高效、特异的表达目的基因。低氧启动rAAV仅在低氧时介导报告基因EGFP的表达。采用6 HRE-CMV-mp-WPRE启动子的rAAV具有良好的低氧特异性和高效启动能力。结论采用最佳的低氧启动子,本研究实现了低氧启动rAAV的构建。; 李桂林王任直王欣栗世方窦万臣张波孔燕国; 关键词：重组腺相关病毒 GFP报告基因 RAAV 蛋白电泳 EGFP 磷酸钙

体外诱导成人成肌细胞转化为神经前体细胞被引量：4: 2006年; 目的探讨成人成肌细胞在体外能否转化为神经前体细胞。方法从成人正常颞肌分离单细胞,体外培养及克隆纯化,培养至第三代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液诱导分化,观察诱导后细胞的形态变化,并进行免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析。结果成肌细胞经诱导后聚集成球,悬浮生长。免疫细胞化学染色见细胞球表达巢蛋白,5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验阳性;细胞分化后表达神经丝蛋白68,胶质纤维酸性蛋白和半乳糖脑苷脂。RT-PCR分析结果与免疫细胞化学染色结果一致。结论成人成肌细胞在体外一定条件下诱导能够转化为神经前体细胞。; 张振兴李桂林窦万臣魏宇魁吴海涛孔燕国范明王任直; 关键词：干细胞成肌细胞神经前体细胞

过氧化物酶增殖物激活受体γ在人垂体ACTH腺瘤中的分布和表达被引量：5: 2006年; 目的研究过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)在人垂体ACTH腺瘤组织中的分布情况和表达水平。方法免疫组织化学染色、Western blot方法检测PPARγ在人正常垂体及ACTH腺瘤中的分布及表达。结果PPARγ主要分布于细胞核,免疫组化和Western blot方法测定,PPARγ在人垂体ACTH腺瘤及正常垂体中均有表达,腺瘤中的表达水平高于正常垂体组织(P<0.05,P<0.01)。结论PPARγ在垂体ACTH腺瘤中表达明显高于正常垂体组织,PPARγ可能成为治疗垂体ACTH腺瘤的一个新靶点。; 夏学巍苏长保许志勤尹剑孔燕国马妍刘伟; 关键词：过氧化物酶增殖物激活受体Γ ACTH 腺瘤垂体

人胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养被引量：4: 2000年; 目的　完成胰腺导管上皮细胞的原代及传代培养 ,建立能够体外长期培养的胰腺导管上皮细胞系。　方法　用含有胶原酶 IA型的消化液消化分离胎儿胰腺组织为细小、均匀的细胞团进行接种 ,接种的细胞团用含10 %胎牛血清、4.0 m mol/L谷氨酰胺、0 .0 1%大豆胰酶抑制剂、0 .0 2 %牛血清白蛋白、5 .0 m g/L牛脑垂体提取物、2 .5× 10 - 3m g/L表皮生长因子、2 5 .0× 10 - 2 m g/L霍乱毒素、5 .0 mg/L胰岛素、10 .0 mg/L转铁蛋白、1.0 m g/L地塞米松、5 0 m g/L庆大霉素的完全培养基培养 2 4h后 ,换含 2 %胎牛血清的完全培养基继续培养 ,在细胞团达到 80 %～ 90 %的细胞汇合时 ,1∶ 2传代培养。　结果　获得的原代培养细胞不含有淀粉酶 ,表达细胞角蛋白 ,可初步认定为胰腺导管上皮细胞。原代培养的胰腺导管上皮细胞已传代培养到第 3代。　结论　我们的原代培养和传代培养的方法、条件适宜于胰腺导管上皮体外细胞培养。; 侯敏陈元方柯杨孔燕国陆国钧; 关键词：原代培养传代培养胰腺导管上皮细胞

颅内电极脑电监测辅助下难治性枕叶癫痫的外科治疗被引量：7: 2012年; 目的初步探索在颅内有创脑电监测下进行难治性枕叶癫痫外科治疗的效果。方法回顾性分析8例应用有创脑电监测的枕叶癫痫病例,所有病例均经过磁共振(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)、头皮视频脑电监测(VEEG)等术前评估,初步判断癫痫起源在枕叶,再应用有创脑电监测,进一步明确致痫区的位置和范围,2期行致痫区手术切除。结果术后无死亡及严重并发症,其中1例视野缺损稍有加重。6例患者术后随访超过1 a,2例患者随访超过半年,其中6例术后无癫痫发作,2例发作次数明显减少。结论颅内电极长程脑电监测对于明确致痫区及视觉皮层、确定并精确切除致痫区具有重要意义,在其辅助下难治性枕叶癫痫的外科疗效提高,并发症减少。; 郭毅郭金竹窦万臣周祥琴卢强金丽日苏长保孔燕国; 关键词：枕叶癫痫外科治疗颅内电极功能区定位

脑膜瘤患者手术前后血清表皮生长因子受体的测定被引量：1: 2002年; 目的探讨脑膜瘤患者手术前后外周血表皮生长因子受体(EGFR)表达含量的临床意义。方法采用ELISA分析53例脑膜瘤患者(42例肿瘤完全切除和11例肿瘤次全切除)手术前后的血清EGFR含量。28例正常献血者为对照组。结果53例脑膜瘤患者手术前血清EGFR含量(352.93±66.18)fmol/ml明显高于对照组(159.11±40.50)fmol/ml(P<0.0001);手术后(220.74±70.63)fmol/ml明显低于术前组(P<0.001)。其中42例肿瘤完全切除患者中38例的EGFR(191.20±32.13)fmol/ml和4例伴有瘤周水肿患者的EGFR(248.75±10.31)fmol/ml明显低于术前组(P<0.001);11例肿瘤次全切除患者的EGFR(322.14±89.53)fmol/ml与术前组比较无显著性差异(P>0.5)。结论92.16%脑膜瘤患者随着肿瘤切除程度的增高而血清EGFR含量越发降低。提示人脑膜瘤细胞可能自主产生EGFR,血清EGFR测定对脑膜瘤患者手术后追踪可能具有临床意义。; 孔燕国苏长保任祖渊王任直; 关键词：围手术期脑膜瘤血清表皮生长因子受体

外周血血管内皮生长因子在垂体腺瘤患者的表达被引量：3: 2004年; 目的探讨外周血中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor VEGF)的表达水平是否可反映垂体腺瘤的生物行为。方法以 203例垂体腺瘤患者、22例垂体增生患者、7例垂体 Rathke 囊肿患者及 3例垂体脓肿患者为研究对象,并以 20例正常献血者为对照组,用酶联免疫吸附法测定各组外周血中 VEGF 水平。结果在垂体疾病患者中,垂体腺瘤患者的血清 VEGF 水平为 (366.8±211.1)pg/m l,垂体增生患者为 (286.8±107.6)pg/m l,分别高于垂体 Rathke 囊肿患者 (180.5±61.7)pg/m l、垂体脓肿患者 (147.5±46.3)pg/m l 和正常对照组 (180.8±56.2) pg/m l, 差异均具有显著性 (P <0.05)。在垂体腺瘤患者中 , 大腺瘤 (380.0±234.5) pg/m l 和巨大腺瘤(380.1±280.3)pg/m l分别高于微腺瘤 (294.6±111.6)pg/m l和垂体增生,差异有显著性差异 (P <0.05)。而血清VEGF 在垂体腺瘤是否具有侵袭性生长、卒中、囊性变和激素分泌类型上表达无差异 (P >0.05)。结论外周血VEGF 水平可反映垂体腺瘤生长大小的生物学行为不能反映垂体腺瘤是否具有侵袭性生长、出血卒中、囊性变及激素分泌类型。检测外周血中 VEGF 水平对垂体腺瘤与垂体 Rathke 囊肿。; 孔燕国任祖渊苏长保王任直幸兵; 关键词：垂体肿瘤血管内皮生长因子

重组1和2型腺相关病毒转导增强绿色荧光蛋白在大鼠脑中的表达被引量：8: 2005年; 目的　探讨重组1、2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体经不同途径向大鼠脑转入增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的表达情况,选择更加适于中枢神经系统(CNS)转基因治疗的rAAV血清型和可行的基因转入途径。方法　将24只雄性健康成年SD大鼠随机分为4组:rAAV1海马注射组、rAAV1脑室注射组、rAAV2海马注射组和rAAV2脑室注射组,每组6只大鼠。对每组大鼠立体定向注射剂量和滴度相匹配的rAAV1 EGFP和rAAV2- EGFP载体,分别于注射后2周和4周处死大鼠取脑,行序列冰冻切片并以荧光显微镜观察EGFP在脑内的表达情况,计算EGFP在脑的表达体积。结果　2周时各组小鼠EGFP表达量少或无表达,差异无统计学意义; 4周时rAAV1海马注射组表达体积为(7 .00±0. 98)mm3,rAAV2海马注射表达体积为(0. 81±0 .28)mm3 (P<0 .01); 4周时AAV1脑室注射组表达体积为(12 .72±0 .28)mm3, AAV2脑室注射组表达体积为(0 .24±0. 13)mm3(P<0 .001)。结论　在CNS中rAAV1是一种比rAAV2更为优越的转基因载体,rAAV1可通过脑室内注射途径在CNS高表达,并可直接转导胶质细胞。; 栗世方王任直李桂林扈国杰张波窦万臣顾建刚张振兴孔燕国魏俊吉魏宇魁田宇; 关键词：脑室注射腺相关病毒转导 EGFP 报告基因

人成肌细胞向神经前体细胞转分化及在大鼠体内移植的研究: 2006年; 目的探讨成人成肌细胞能否转分化为神经前体细胞。方法从6例成人正常颞肌标本中分离培养成肌细胞,培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的无血清培养液,诱导2周,对诱导细胞进行免疫细胞化学鉴定和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析;将诱导细胞和人成肌细胞分别移植到12只脑缺血大鼠脑内,采用免疫组织化学植细胞的存活和分化进行鉴定。结果成肌细胞在经诱导7 d 后开始聚集成球,悬浮生长,该细胞球平均每14 d 传代1次。细胞球均表达巢蛋白,在分化条件下,(36±6)%的细胞表达微管相关蛋白2,(44±5)%的细胞表达胶质纤维酸性蛋白,(17±4)%的细胞表达半乳糖脑苷脂;经诱导细胞移植到大鼠脑内后表达微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白。而对照组的成肌细胞则不表达上述标志物。结论人成肌细胞在体外一定诱导条件下能够转分化为神经前体细胞。; 张振兴王任直李桂林窦方臣栗世方魏俊吉魏宇魁赵飞帆孔燕国吴海涛范明; 关键词：干细胞神经再生成肌细胞

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孔燕国

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