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构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装被引量：3: 2010年; 背景:腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题。应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题。目的:实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装。方法:应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果与结论:通过聚合酶链反应获得长度为347bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因。pMD18-T载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒。; 薛美思刘毅; 关键词：胰岛素绿色荧光蛋白克隆基因表达慢病毒表达载体

携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究被引量：15: 2010年; 目的构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的转染情况,为今后组织工程脂肪构建与体内回植研究奠定基础。方法采用DNA重组技术,将insulin基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-EGFP中,筛选阳性克隆,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP共同转染到293T细胞内包装病毒,荧光倒置相差显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况。收集病毒上清,纯化浓缩,测定重组病毒的滴度。取足月儿脐带以组织块培养法分离培养hUCMSCs,以不同感染复数(multiple of infection,MOI,分别为0、1、3、5、7、10、15、20)的重组慢病毒感染hUCMSCs,通过报告基因绿色荧光蛋白的表达筛选最适MOI;以最适MOI重组慢病毒感染hUCMSCs,应用实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测细胞中insulin基因及insulin蛋白水平的表达情况。结果成功构建了共表达insulin基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并对其成功包装、纯化及浓缩,病毒滴度为1.3×108TU/mL。不同MOI的重组慢病毒感染hUCMSCs后,通过绿色荧光蛋白表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为10,此时对细胞的转染效率可达到90%。实时荧光定量PCR检测示转染组insulin mRNA表达阳性,未转染组为阴性;Western blot检测示转染组细胞内及上清液insulin蛋白表达阳性,未转染组均为阴性。结论构建的携带insulin基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP可有效转染hUCMSCs,表达insulin蛋白。; 刘毅薛美思; 关键词：组织工程脂肪人脐带间充质干细胞胰岛素绿色荧光蛋白基因转染慢病毒表达载体

适宜于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架的筛选: 背景:蚕丝蛋白是一种新的组织工程支架材料,以人脐带间充质干细胞为种子细胞构建组织工程脂肪时,有必要了解蚕丝蛋白支架的适宜孔径。目的:筛选适宜于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架。设计、时间及地点:细胞学与组织形态学体外研究,...; 刘毅肖宏涛薛美思; 文献传递

眶隔脂肪下移经皮外固定在睑袋整复术中的应用被引量：1: 2012年; 目的：探讨眶隔脂肪下移经皮外固定在伴睑颊沟凹陷畸形睑袋整复术中的应用效果。方法：常规行睑袋整复术的同时，沿下眶骨缘向下在骨膜表面充分剥离术前标记的睑颊沟凹陷范围，形成一袭腔，并将眶隔脂肪修整成脂肪垫使眶隔脂肪尽量平整铺于囊腔，并用尼龙线外固定。结果：本组119例，均进行了3～12个月的随访，随诊观察下睑袋及泪眶沟均消失，下睑形态自然，曲线圆滑，效果稳定，受术者自觉外观满意。结论：眶隔脂肪下移经皮外固定用于伴睑颊沟凹陷畸形的睑袋整形术，能解决常规睑袋整形术后下睑局部凹陷而不圆润的问题。此法既能使下睑袋及泪眶沟均消失，又能恢复下睑曲线圆滑的自然形态，且效果稳定。; 侯勇李茂玉刘唯高锦越熊艳薛美思; 关键词：睑袋整形术

脐带间充质干细胞在细胞治疗中的研究进展被引量：13: 2008年; 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化成神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞及脂肪细胞等。随着对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，目前已经从多种组织中分离出MSC。; 薛美思刘毅; 关键词：间充质干细胞细胞治疗多向分化潜能细胞生物学特性脐带自我更新能力体外培养扩增

适宜于构建组织工程化脂肪的蚕丝蛋白支架:最佳孔径筛选被引量：12: 2010年; 背景:既往组织工程脂肪的研究中,支架材料的孔径往往被忽略。如孔径过大,细胞会顺着过大的孔隙流走,难以保留在支架中;孔径过小,细胞则主要分布于支架材料的表面,不易进入支架中,同时也不利于新生血管生长。目的:筛选用于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架的适宜孔径。方法:在保持蚕丝蛋白浓度不变条件下,通过改变冷冻-干燥温度与时间,制备出6批次不同孔径的蚕丝蛋白支架;贴壁法分离脐带间充质干细胞,化学染色检测其体外诱导成骨和成脂的能力;电镜下测定6批次蚕丝蛋白支架的孔径;观察脐带间充质干细胞在不同孔径蚕丝蛋白支架上黏附、增殖的能力。结果与结论:6批次蚕丝蛋白支架的孔径分别为:(39.94±17.27),(53.51±16.18),(63.97±19.76),(71.08±18.07),(87.33±21.78),(121.97±44.10)μm。脐带间充质干细胞在2号支架材料上黏附良好,并充分伸展,而第1,3,4,5,6号支架材料,除第1,3号支架上偶见细胞外,其余支架材料上均未见细胞生长。由此说明人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪时,支架材料的最佳孔径为50μm。; 刘毅肖宏涛薛美思; 关键词：孔径组织工程脂肪脐带间充质干细胞

适宜于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架的筛选: 背景蚕丝蛋白是一种新的组织工程支架材料,以人脐带间充质干细胞为种子细胞构建组织工程脂肪时,有必要了解蚕丝蛋白支架的适宜孔径。目的筛选适宜于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架。设计、时间及地点细胞学与组织形态学体外研究,于20...; 刘毅肖宏涛薛美思; 关键词：脐带间充质干细胞组织工程脂肪; 文献传递

携带人胰岛素基因慢病毒载体转染脐带间充质干细胞的实验研究: 目的:构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilic...; 薛美思刘毅; 关键词：间充质干细胞重组慢病毒载体慢病毒感染人胰岛素基因; 文献传递

携带重组人胰岛素基因的慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究: 目的：1.探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stemcells hUCMSCs)体外分离、培养、纯化条件，并对hUCMSCs的生物学特性进行研究;2.构建含人重组胰...; 薛美思; 关键词：EGFP基因脐带间充质干细胞慢病毒载体胰岛素基因生物学特性; 文献传递

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