周志刚
- 作品数：165 被引量：317H指数：11
- 供职机构：上海海洋大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划上海市教育委员会创新基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学环境科学与工程医药卫生更多>>
- 缺刻缘绿藻二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)的基因特性与功能鉴定被引量：1
- 2013年
- 酰基-CoA—二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是微藻等植物三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。为了解析缺刻缘绿藻TAG合成代谢的途径,在该藻转录组测序数据库中,通过同源搜索,发现了1个编码DGAT2的cDNA全长序列。该序列长1 997 bp,其中5'-非翻译区(UTR)长44 bp,3'-UTR长897 bp,开放阅读框(ORF)长1 056 bp,编码1个含有351个氨基酸的蛋白质,预测的分子量为39.43 ku,等电点为9.46。基于缺刻缘绿藻和其他物种相应的DGAT基因编码蛋白序列所构建的Neighbor-Joining(NJ)系统进化树,结果表明该基因与DGAT2聚成一支,显著不同于DGAT1和DGAT3。氨基酸序列比对发现,该基因编码产物含有DGAT2所具有的HPHG这4个氨基酸所组成的高度保守特征序列。因此,将该基因命名为MiDGAT2。将它的cDNA与其DNA序列进行比较后发现,MiDGAT2含有6个内含子,其剪接位点均符合"GT-AG"规则。为进一步了解其功能,利用反转录PCR克隆了该基因的ORF序列,然后将其亚克隆到表达载体pYES2中,成功地构建了重组表达质粒pY-MiDGAT2。通过电穿孔法将该重组质粒转入酿酒酵母TAG合成缺陷株H1246中,经筛选与序列验证得到含有重组质粒pY-MiDGAT2的酵母转化株。酵母转化株在用SC培养基并加入半乳糖诱导表达培养后,其脂类的薄层色谱分析结果表明,所转的MiDGAT2基因能使酵母转化株恢复TAG合成的能力,从而证实了MiDGAT2基因具有DGAT的功能;利用荧光染料Bodipy对酵母细胞的染色结果显示,MiDGAT2基因能使酵母转化株的细胞重现油滴,尽管重建的油滴大小明显比野生型酵母的小。
- 房逢立吴洪周志刚
- 关键词：缺刻缘绿藻酿酒酵母
- 双色原位杂交显示海带配子体5SrDNA与45SrDNA的非连锁关系被引量：1
- 2018年
- 不等鞭毛类（stramenopiles）许多物种的报道认为,5SrRNA基因与其45SrRNA基因存在连锁关系,但通过设计不同引物进行PCR反应的探索,在海带中没有获得连锁的数据。为了从细胞学角度给予直观的证据,本研究基于海带5SrRNA及45SrRNA基因序列特征分析的基础上,利用双色荧光原位杂交（FISH）的技术和原理,以海带5SrRNA与45SrRNA基因的DNA为模板分别合成带有不同生物素荧光标记的探针,然后杂交到海带配子体的染色体上。FISH图片显示,红色标记的18S-5.8S-25S rDNA探针与绿色标记的5SrDNA探针,在同一幅海带配子体的染色体图片上都只出现了一个杂交信号;从大到小排列的核型显示,45SrDNA及5SrDNA分别定位于海带配子体的第23号和第27号染色体上,直观而清晰地表明5SrDNA并没有与45SrDNA连锁。这是首次尝试性地利用双色荧光原位杂交技术探讨藻类rDNA的染色体定位报道,这个结论有助于将FISH技术应用在海带染色体核型分析等研究。
- 刘宇董无善刘丽周志刚
- 关键词：FISHRDNARDNA
- 能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记
- 本发明属于基因工程技术领域，具体为一种能辨别海带雌、雄配子体的特异性分子标记。该特异性分子标记由下述方法获得：根据海带雌、雄配子体1hcf6基因的5′－侧翼序列设计两对引物SEQ ID No1和SEQ ID No2，对海...
- 周志刚刘艳省毕燕会李利华
- 文献传递
- 海带PEPC功能区的原核重组表达及功能鉴定
- 2024年
- 与其他大型海藻一样,海带同样具备无机碳浓缩机制(CCM),以实现高光合作用效率和生产力。胞质磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)被认为是海带CCM的重要组件,但目前尚没有关于海带胞质PEPC相关研究报道。本研究自海带配子体全长转录组数据库中筛选到一条可能位于细胞质的PEPC编码基因的cDNA全长序列。通过RT-PCR方法验证,获得SjPEPC基因的cDNA全长,为3503 bp,包含2850 bp的完整开放阅读框、50 bp的5'-UTR和603 bp的3'-UTR。SjPEPC编码一个含949个氨基酸残基的蛋白,相对分子质量为104.91 ku,等电点为7.31。多序列比对显示PEPC的功能位点在不同物种中高度保守,系统演化及序列结构分析表明SjPEPC属于细菌型的PEPC。选取编码SjPEPC功能区的核苷酸序列,利用同源重组技术构建了pET32a-SjPEPC原核表达载体,经过诱导和纯化,得到了分子质量大小为86.3 ku的重组蛋白(rSjPEPC),酶活性测定结果显示,rSjPEPC具有催化PEP发生羧化的活性,比活力为(9.37±0.46)U/mg prot。研究表明,PEPC在海带无机碳储存中可能具有重要功能。本研究可为进一步解析海带CCM提供了分子和生物化学证据。
- 秦天明金迷娜方佩佩毕燕会周志刚
- 关键词：海带配子体磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活性测定
- 缺刻缘绿藻FAD基因的序列特征及其相对转录量对氮饥饿的响应被引量：3
- 2012年
- 为探讨缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)花生四烯酸(20:4 6,AA)合成过程中一系列脂肪酸去饱和酶(FAD)的作用,本研究克隆了12、6及5 FAD基因的cDNA全长序列(GenBank登录号分别为JN205757、JN205755和JN205756)及其相应的DNA序列。它们的cDNA全长分别为1 806 bp、2 674 bp及2 318 bp,其中ORF长为1 137bp、1 443 bp和1 446 bp,分别编码由378、480和481个氨基酸组成的蛋白;通过其cDNA与DNA序列的比对,发现12、6及5 FAD基因分别具有4、5和7个内含子,其剪切位点均符合"GT-AG"规则。Δ12、Δ6和Δ5 FAD编码蛋白均富含疏水性氨基酸,约占各自氨基酸组成的52.8%、46.6%及50.9%。密码子的偏好性与缺刻缘绿藻其他基因保持一致。推测这3个FAD基因编码蛋白都存在4个跨膜区,而12和5 FAD还各有一个明显不跨膜的疏水区;都具有FAD家族各自相对保守的3个组氨酸簇基序。基于缺刻缘绿藻和其他物种相应的FAD基因编码蛋白序列所构建的Neighbor-joining(NJ)系统进化树,表明Δ12、Δ6、Δ5及ω3 FAD分别隶属于各自的分支,其中,Δ12与ω3 FAD的亲缘关系较近,而Δ6与Δ5 FAD具有较近的亲缘关系。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)分析这3个FAD基因在缺刻缘绿藻缺氮培养96 h后又恢复氮培养72 h过程中的相对转录量,结果表明这3个基因的相对转录量都受到氮信号的调控,它们随着氮饥饿培养时间延长明显上升,而氮恢复培养后迅速并显著地下降到氮饥饿胁迫前的水平。结合已知脂肪酸成分在此过程中的变化,推测这3个基因对缺刻缘绿藻AA的合成和积累都起着重要的作用,而Δ6 FAD的作用可能更关键。
- 刘凡李慧李春阳欧阳珑玲周志刚
- 关键词：缺刻缘绿藻脂肪酸去饱和酶基因克隆实时荧光定量PCR
- 一种提高MiDGAT1在啤酒酵母中的三酰甘油合成能力的多肽及其用途
- 本发明涉及一种提高MiDGAT1在啤酒酵母中的三酰甘油合成能力的多肽及其用途。具体地，本发明克隆获得一种新的DGAT基因，命名为MiDGAT1，并获得一种新的PH结构域序列，通过基因功能互补实验，发现MiDGAT1和Mi...
- 周志刚陈春秀
- 文献传递
- 植物雄配子体发育的分子机理研究进展
- 2010年
- 植物雄配子体发育是生殖过程中的一个关键步骤,其生物学过程主要包括:小孢子经过不对称的有丝分裂形成1个营养细胞和1个生殖细胞,生殖细胞再经过第两次有丝分裂形成2个雄配子。该发育过程是众多基因参与的一系列细胞分化的体现,因此雄配子体是研究细胞分化发育分子机理的理想材料。近年来,随着分子生物学和遗传学的发展,以模式植物拟南芥为代表的雄配子体发育研究取得很大进展,并发现一些雄配子体发育调控过程中细胞分裂、分化和互作的重要基因。本文主要介绍植物雄配子体发育过程相关主要基因的功能,并概述这些功能基因在雄配子体发育过程中分子机理研究进展。
- 许杰李素玲周志刚
- 关键词：雄配子体有丝分裂细胞分化
- 海带全基因组DNA提取方法
- 本发明提供了一种海带全基因组DNA提取方法。在传统的海藻基因组DNA提取方法中，多采用CsCl超速离心、柱层析纯化等物理或化学方法以减少多糖污染，既不经济又繁琐、耗时。本方法的特征在于将海带孢子体实验材料清洗、经适量的褐...
- 周志刚胡远皆
- 文献传递
- 编码缺刻缘绿藻乙酰辅酶A羧化酶BCCP亚基的基因克隆与表达分析
- 2014年
- 为了探讨在氮饥饿对缺刻缘绿藻花生四烯酸(ArA)合成与积累的影响,通过cDNA末端快速扩增(RACE)和设计简并引物进行反转录(RT)-PCR扩增,克隆了编码该藻异质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的2个生物素羧基载体蛋白(BCCP)的基因序列。其中MiBCCP1基因的cDNA序列长1 267 bp,包含的5'-非翻译区(UTR)长44 bp,3'-UTR长524 bp,开放阅读框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸并含有45个氨基酸序列的叶绿体定位信号肽;预测成熟蛋白分子量约为20 ku。MiBCCP2基因的ORF长789 bp,编码263个氨基酸并含有49个氨基酸的叶绿体定位信号肽,推测成熟蛋白分子量约为22 ku,但其羧基端缺乏生物素酰基化位点。邻接法(NJ)构建的聚类图显示它们分属于2个不同的分支(靴带值为100)。采用半定量反转录(RT)-PCR技术分析这2个基因的表达量,结果显示,在氮饥饿光照培养条件下,它们的相对转录量都先短暂升高然后持续下调,从而表明缺刻缘绿藻脂肪酸的从头合成能力有下降的趋势。结合该藻的ArA含量在该培养条件下明显增加的结果,推测胞质中同质型ACCase对缺刻缘绿藻ArA合成与积累起着更重要的作用。
- 李燕周志刚
- 关键词：缺刻缘绿藻乙酰辅酶A羧化酶
- 海带3个着丝粒蛋白编码序列的克隆及特征分析
- 2016年
- 本研究根据海带基因组及糖海带转录组数据库中获得的编码着丝粒相关蛋白CENH3、Nuf2和Ndc80的contig序列设计特异性引物,利用PCR技术自海带中克隆得到它们的开放阅读框(ORF)序列,分别命名为Sj CENH3、Sj Nuf2和Sj Ndc80,大小分别为432、1365和2172 bp,相应地编码由143、454和723个氨基酸组成的蛋白。同源序列比对表明,Sj CENH3由氨基端尾巴和羧基端的组蛋白折叠域组成,后者包括4个α螺旋(αN、α1、α2和α3)和2个环(Loop1和Loop2);但与组蛋白H3相比,Sj CENH3的氨基端略长且序列不相似,同时组蛋白折叠域的α1、α2螺旋及Loop1序列更多变;Sj Nuf2主要的结构域有Nuf2 domain、Spc7和SPT2;Sj Ndc80主要的结构域除了具有与Sj Nuf2相似的SPT2和Spc7结构域以外,还有Ndc80_Hec、Fo P_duplication和Kin17_mid。基于海带和其他物种的CENH3、H3、Nuf2和NCD80蛋白序列所构建的Neighbor-Joining系统进化树显示,Sj CENH3和Sj H3分别被显著地聚类在CENH3和H3两支中,H3在物种间是高度保守的,而CENH3在物种间的差异相对较大;来自不同生物的Nuf2和NCD80均可显著地分为被子植物和藻类2支,它们可能存在着共同演化的关系。本研究首次报道了海带着丝粒蛋白Sj CENH3、Sj Nuf2和Sj NCD80编码序列的特征,为制备特异抗体通过免疫荧光技术来定位海带染色体着丝粒的具体位置,通过染色质免疫共沉淀获得海带染色体着丝粒DNA序列及进行染色体核型分析打下了良好的基础。
- 徐梅周志刚
- 关键词：海带动粒蛋白基因克隆生物信息学
