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沈微: 作品数：150 被引量：708H指数：12; 供职机构：江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室更多>>; 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金长江学者和创新团队发展计划更多>>; 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程农业科学更多>>

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利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统被引量：14: 2014年; 热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力,但二倍体遗传结构和较低的遗传转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。建立可靠的遗传转化技术并高效的删除目的基因是代谢工程改造热带假丝酵母的重要前提。文章以C.tropicalis ATCC 20336为出发菌株,通过化学诱变筛选获得了尿嘧啶缺陷型突变株C.tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因作为靶基因构建了两端包含同源臂并在选择性标记C.tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase,乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶)基因两侧同向插入源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisGPDC1(PHUHP),并转化宿主菌株C.tropicalis XZX,筛选获得PHUHP片段正确整合到染色体的PDC基因位点的转化子XZX02。在此基础上,将转化子XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)选择培养基上,筛选得到URA3基因从PHUHP片段中丢失的营养缺陷型菌株XZX03。进一步构建了第2个PDC等位基因的删除表达盒PDCmURA3-PDCm,并转化C.tropicalis XZX03菌株,获得转化子C.tropicalis XZX04。经PCR和DNA测序确认转化子C.tropicalis XZX04细胞染色体上的两个PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一种营养缺陷型标记可重复使用的热带假丝酵母遗传转化技术,利用该技术成功敲除了细胞的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造热带假丝酵母奠定了基础。; 项峥陈献忠张利华沈微樊游陆茂林; 关键词：热带假丝酵母同源重组基因敲除

一种高耐热普鲁兰酶的克隆表达、酶学性质及其在粉丝制作中的应用被引量：2: 2020年; 为了获得一种适合在粉丝制作中使用的高耐热普鲁兰酶,对Thermus thermophilus的普鲁兰酶基因进行了异源表达及应用性质研究。以T.thermophilus XQ5331基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增获得普鲁兰酶编码基因TtP5331,在大肠杆菌中实现高效表达。重组酶TtP通过离子交换层析获得初步纯化。酶学性质研究结果显示,重组酶最适作用温度为75℃,最适pH6.5,在最适条件下比酶活为17 U/mg。重组酶TtP在90℃下保温10 min仍能保留约60%的酶活,沸水浴5 min可以完全灭活。在传统粉丝制作工艺基础上,采用先加酶后制芡糊的方式制作粉丝,按照每克芡糊淀粉1 U的量添加TtP处理芡糊,制作的粉丝的断条率为4.5%,与添加明矾获得的粉丝基本一致。以上结果说明,在酶法粉丝制作工艺中,TtP适合在芡糊制作前在淀粉悬液中添加,是一种用量小、使用简便的明矾替代物。; 孙利鹏德青美朵朱新文姚雁王婕祝冬君沈微; 关键词：粉丝普鲁兰酶异源表达

代谢工程改造热带假丝酵母高效合成中链ω-羟基脂肪酸被引量：1: 2022年; 【目的】ω-羟基脂肪酸(ω-hydroxyfatty acid,ω-HFAs)是一种绿色安全无毒,具有良好生物相容性的理想生物降解材料,广泛应用于化工、食品、药学等方面,微生物发酵法生产ω-羟基脂肪酸具有重要的研究意义和应用前景。【方法】为了得到高产ω-羟基脂肪酸的代谢工程菌株,通过同源重组技术,连续敲除二倍体热带假丝酵母β-氧化途径中酰基辅酶A氧化酶基因(ACO)的同工酶POX基因,考察基因缺失对细胞生长以及合成ω-羟基脂肪酸能力的影响。【结果】基于脂肪醇氧化酶(FAO)基因缺陷菌株,成功构建了重组菌株F4PT(ΔPOX4,ΔPOX5),在碳源为葡萄糖的培养基中,重组菌株出现生长减缓,但在碳源为脂肪酸甲酯(C12–C14)的培养基中生长明显减缓,说明删除POX4、POX5基因使脂肪酸甲酯的代谢能力降低,其次通过摇瓶发酵实验,12-羟基十二酸和14-羟基十四酸的产量分别为3.01 g/L和8.69 g/L,转化率分别为11.44%和33.14%,达到积累ω-羟基脂肪酸的目的,并且代谢十四酸甲酯的能力是明显强于代谢十二酸甲酯。【结论】FAO、POX基因双缺失的热带假丝酵母可以明显积累ω-羟基脂肪酸,不同碳链的积累效率有差异,其中14-羟基十四酸的产量及转化率更高,重组菌株有定向转化十四酸甲酯为14-羟基十四酸的潜能。; 王世杰张海冰沈微杨海泉夏媛媛曹钰陈献忠; 关键词：热带假丝酵母精细化工品

粗糙脉孢菌突变菌株合成漆酶的发酵条件研究被引量：1: 2005年; 研究了影响粗糙脉孢菌突变菌株合成漆酶的一些摇瓶发酵条件,包括通气量、培养温度、甲醇浓度、Cu2+浓度等。结果表明,在500m L三角瓶中装入含150μm olL/C u2+浓度的发酵培养基B M M Y 50m L,接种后于30℃,200rm/in培养7d,用0.5%甲醇诱导,在第5天时漆酶酶活最高可达3.88u m/L。; 谌斌唐雪明沈微方惠英诸葛健; 关键词：粗糙脉孢菌突变菌株漆酶发酵条件

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质被引量：7: 2017年; 用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因Gs P,在大肠杆菌中进行异源表达。在没有外源信号肽的条件下,重组酶部分分泌到周质中,少量分泌到培养液中。重组酶表观分子量约为81 k Da,纯酶比活力为38.2 U/mg。重组酶最适温度为60℃,能短时耐受70℃高温;重组酶最适pH6.5,在pH5.5~7.5的范围内具有较好的稳定性;重组酶Km值为0.086μmol/L,Vmax为0.083μmol/min;K+和Mg^(2+)对重组酶有激活作用,而Ca^(2+)则有抑制作用。重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖,对直链淀粉未发现降解作用,是一种I型普鲁兰酶。重组酶Gs P在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景。; 肖亚朋沈微李婷霖陈献忠樊游; 关键词：异源表达蛋白纯化酶学性质

理性设计和构建过量合成莽草酸的大肠杆菌代谢工程菌被引量：4: 2013年; 利用代谢工程手段理性改造野生大肠杆菌的莽草酸(Shikimic acid,SA)合成途径及相关代谢节点,以构建高产莽草酸的工程菌株。根据细胞代谢网络分析,利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌CICIM B0013的莽草酸激酶基因(aroL、aroK),葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键组分EIICBglc的编码基因(ptsG)以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因(ydiB)并系统评价了基因删除对细胞的生长、葡萄糖代谢和莽草酸积累的影响。aroL、aroK的删除阻断了莽草酸进一步转化成为莽草酸-3-磷酸,初步提高莽草酸的累积。删除ptsG基因使大肠杆菌PTS系统部分缺失,细胞通过GalP-glk(半乳糖透性酶-葡萄糖激酶)途径,利用ATP将葡萄糖磷酸化后进入细胞。利用该途径运输葡萄糖能够减少PEP的消耗,使得更多的碳代谢流进入莽草酸合成途径,从而显著提高了莽草酸的产量。在此基础上删除ydiB基因,阻止了莽草酸合成的前体物质3-脱氢奎宁酸转化为副产物奎宁酸(Quinic acid,QA),进一步提高了莽草酸的累积。初步发酵显示4个基因缺失的大肠杆菌代谢工程菌生产莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍。; 李明明陈献忠周丽沈微樊游王正祥; 关键词：大肠杆菌基因删除莽草酸代谢工程

根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母的遗传转化: 根癌农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)可以将它的Ti质粒的一段T-DNA序列转化到广泛的宿主细胞并能整合到宿主染色体中.研究通过构建质粒pCAM 3300-Zeocin,将其电击转化根癌农杆菌.通...; 张君胜饶志明沈微方慧英诸葛健; 关键词：产甘油假丝酵母根癌农杆菌; 文献传递

GenBank数据库中微生物rDNA序列准确性研究被引量：3: 2012年; rDNA序列同源性分析是目前常用的一种微生物分子鉴定方法。在该方法中,待鉴定微生物的rDNA序列需要与GenBank数据库中的相关序列进行同源性比对,从而得出该菌株的具体种属。从GenBank数据库中收集了细菌16S rDNA序列、丝状真菌ITS序列以及酵母26S rDNA D1/D2区域序列共88条,通过BLAST比对和构建系统发育树的方法对所收集rDNA序列的准确性进行了验证。结果发现有17条序列(19.3%)的长度过短,无法提供足够的系统发育信息;5条序列(5.6%)存在错误命名或测序不准确问题;58条序列(65.9%)没有相关文章发表;62条序列(70.4%)无法获取对应的微生物保藏物。从而提示了GenBank数据库的有限参考价值,在微生物分子鉴定过程中需要对相关rDNA序列的准确性进行验证。; 陈源源沈微樊游石贵阳王正祥; 关键词：微生物鉴定 GENBANK数据库 RDNA序列

基于学科交叉融合的微生物学实验教学改革探索被引量：7: 2016年; 微生物学作为实践性较强的一门学科,是生物工程专业和生物技术专业最重要的基础课程之一。微生物实验教学具有与理论教学同样甚至更重要的地位。江南大学生物工程学院在总结多年教学实践的基础上,对微生物实验教学进行了系列改革探索。基于多学科交叉融合的知识体系和递进提高式教学理念,将实验课程分为单元操作实验、综合型实验、设计型实验和创新型实验。同时,对课程考核模式也做了相应的改革。实践表明,教学改革使得课程设置更科学合理,学生学习兴趣极大提高,教学效果显著提升。; 陈献忠樊游沈微; 关键词：教学改革教学质量

人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达被引量：4: 2007年; 利用重叠PCR技术拼接PTH和HSA基因,并将构建好的融合基因插入到载体pUC19测序后插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOXⅠ和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白PTH-HSA。重组质粒pPIC9K/PTH-HSA经SalI线性化后,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到的转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到表达;Westernblot分析表明发酵液上清中表达的融合蛋白PTH-HSA具有HSA的抗原性:用酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318IU/ml。; 王俊沈微饶志明诸葛健; 关键词：人甲状旁腺激素融合蛋白毕赤酵母

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