孙敏华
- 作品数：50 被引量：144H指数：6
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- 新城疫病毒V和W基因真核表达产物对DF-1细胞凋亡的影响
- 2014年
- 将含新城疫病毒（NDV）疫苗株LaSota和强毒株GM V和W基因的真核表达质粒pEGFP-La V、pEGFP-La W、pEGFP-GM V和pEGFP-GM W转染鸡胚成纤维细胞（DF-1）。转染24h后，用荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP在细胞中显著表达。分别于转染后24、36h和48h用流式细胞仪测定表达产物对DF-1细胞凋亡的影响。结果表明，随着转染时间的增加，细胞早期凋亡率逐渐上升。在质粒转染后24h ， pEGFP-GM V、pEGFP-GM W、pEGFP-La V和pEGFP-La W真核表达产物诱导DF-1细胞的凋亡率在14 T.26％～17.09％之间，差异不大，但都明显高于空载体组。而在质粒转染后36h ，pEGFP-GM V、pEGFP-GM W真核表达产物诱导细胞凋亡率分别为45.05％和43.4％，明显高于pEGFP-La V 和pEG-FP-La W诱导的31.44％和38.64％的凋亡率。在质粒转染后48h ，pEGFP-GM W和pEGFP-La W真核表达产物诱导细胞凋亡率均超过50％， pEGFP-GM W 真核表达产物诱导细胞凋亡率达到了43.4％，而pEGFP-La V真核表达产物诱导细胞凋亡率最低，为33.44％。由此表明，来源于不同毒力 NDV毒株非结构蛋白V和W均能诱导早期细胞凋亡，但是诱导细胞凋亡能力存在一定的差异。
- 汪招雄康银峰孙敏华高诗敏谢鹏任涛
- 关键词：新城疫病毒真核表达细胞凋亡
- 鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒二重PCR检测方法的建立被引量：5
- 2015年
- 参考Gen Bank上已发表的鸭坦布苏病毒(DTMUV)NS5基因序列和产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列,分别设计了检测DTMUV和EDSV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为242 bp和181 bp。通过退火温度及引物浓度的优化,建立了针对这两种病毒的二重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测DTMUV和EDSV,且不与鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒以及大肠杆菌的核酸发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对DTMUV的最低检出限为590个拷贝,对EDSV的最低检出限为3 260个拷贝;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过检测两种病毒感染的阳性病料各10份,结果显示,该二重PCR检测方法对阳性样品的检出率可达100%。这表明该方法可以用于鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒的检测。
- 孙敏华李林林董嘉文袁建丰邝瑞欢胡奇林
- 关键词：二重PCR
- 禽呼肠病毒σC基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立
- 2012年
- 将RT-PCR扩增得到的禽呼肠病毒(ARV)S1133毒株的σC基因克隆至pMD-18T-Simple载体,经酶切及测序鉴定,证明该基因片段为ARVσC基因。将该基因亚克隆至pET32a(+)成功构建了表达载体pET32a-σC。该重组质粒在大肠埃希菌BL21中经1.0mmol/L IPTG诱导5h得到最佳表达。pET32a-σC蛋白的分子质量为55ku,Western blot分析表明,该重组蛋白能与ARV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。将纯化好的ARVσC蛋白作为包被抗原,确定了该方法的抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清的最适稀释度为1∶400。用建立的ELISA方法检测接种过ARV疫苗的65份临床血清样品,测得44份为阳性,阳性率为67.7%;未接种ARV疫苗的30份血清样品检测结果均为阴性。
- 董嘉文孙敏华李林林胡奇林
- 关键词：禽呼肠病毒酶联免疫吸附试验
- 鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及其F基因、HN基因的序列分析被引量：2
- 2010年
- 利用RT-PCR技术,将从江苏省分离到的2株鸽源NDV的融合蛋白(F)和血凝素神经氨酸酶(HN)基因重要功能区片段进行扩增和序列分析,发现F蛋白多肽裂解位点的氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株序列特点。F基因分型及同源性比较显示,分离到的2株鸽源NDVPG-CH-JS-1-05,PG-CH-JS-1-06属基因Ⅵ型。与国内参考毒株YN-P1F基因推导的氨基酸序列同源性最高为96.4%,与LaSota的同源性为84.1%～84.2%,与F48E9的同源性为86.0%～86.2%;与国外参考毒株Warwick66的同源性为92.7%～93.3%;HN基因氨基酸序列同源性比较显示,与PB9601的同源性最低,只有3.4%～3.7%,与LaSota的同源性也较低,为88.5%～88.7%。而与国外参考毒株IT-227-82的氨基酸序列同源性为95.4%～95.6%,与Pigen-NY-US-1984的同源性为94.8%～94.9%,与248VB的同源性为92.5%～92.7%,说明与国外鸽源NDV分离毒株的遗传距离较近。
- 陈钟鸣刘怀然孙敏华戴鼎霞张志成方光远孔宪刚
- 关键词：新城疫病毒F基因HN基因基因型
- 基因VIb亚型半番鸭源新城疫病毒基因组测序及分析
- 2012年
- 根据GenBank上发布的新城疫病毒基因组序列,设计了9对引物,对从福建福州地区发病半番鸭场分离的新城疫病毒FJ-SMD-03株进行了基因组cDNA扩增测序和分析.结果表明:FJ-SMD-03的基因组序列由15 192 nt组成,在NP基因非编码区比Lasota株多了6个核苷酸ACACTC;基因组由6个ORF组成,即3'-NP-P-M-F-HN-L-5'序列.BLAST结果显示:FJ-SMD-03基因组核苷酸与1.3、carrier-pigeon/Guangdong/2008、pigeon/Italy/1166/00、AV324/96和dove/Italy/2736/00相似性最高,达94.9%～98.5%;与疫苗株Lasota、Mukteswar和B1的相似性最低,为80.7%～83.3%;与我国标准强毒株F48E8及2002年从福建番鸭中分离到的基因VIId亚型强毒株Muscovy duck/China(Fujian)/FP1/02相似性较低,分别为82.5%和87.1%.F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112 R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特征,进化树分析发现,FJ-SMD-03属于ClassⅡ类基因VIb亚型,证明鸭群中有VIb亚型NDV强毒株;FJ-SMD-03株NDV与1.3、carrier-pigeon/Guangdong/2008和pigeon/Italy/1166/00亲缘关系较近,与carrier-pi-geon/Guangdong/2008形成一个小的进化分支,推测FJ-SMD-03株与carrier-pigeon/Guangdong/2008和pigeon/Italy/1166/00株来源于共同的祖代毒株,可能与鸽携带的病毒有关.
- 黄秋芳孙敏华陈少莺吕殿红董嘉文尚毅吴玄光胡奇林
- 关键词：新城疫病毒基因组
- 检测鸭坦布苏病毒NS1抗体ELISA方法的建立被引量：2
- 2017年
- 为了检测鸭群中鸭坦布苏病毒的血清学流行情况,本研究在前期成功表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的基础上,建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。棋盘法确定了当纯化的NS1蛋白包被量为0.188μg/孔,待检血清1:200稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:16000倍稀释时反应条件最佳。在最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6%和10%,显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品,测得52份为阳性,阳性率为94.5%,对36份阴性鸭群血清样品进行检测,36份为阴性,阴性率为100%。该方法为鸭坦布苏病毒的诊断和流行病学监测奠定了基础。
- 孙敏华郭建伟李林林董嘉文邝瑞欢吴玄光张建峰胡奇林张春红
- 关键词：NS1蛋白ELISA
- 2003年～2006年东北地区新城疫病毒部分分离株分子遗传学特征被引量：4
- 2008年
- 本研究从2003年～2006年我国东北地区收集的疑似新城疫病毒感染的鸡源病料中,分离鉴定出12株可在鸡胚成纤维细胞上产生病变的新城疫病毒,并对其进行了蚀斑纯化。应用RT-PCR方法扩增含病毒融合蛋白基因47nt～420nt片段,并进行序列测定及分析。结果表明,12株NDV分离株F蛋白裂解位点序列均为112R-R-Q-K-R-F117。重要中和位点、糖基化位点及半胱氨酸残基高度保守。与GenBank中30株NDV参考毒株F基因序列比较和分析后,发现12株NDV分离株均为基因VⅡd亚型毒株,为我国目前优势流行毒株;与不同地区及宿主来源的参考毒株比较的结果表明本次分离于东北地区的毒株没有明显宿主及地域特征。
- 孙敏华刘怀然孔宪刚刘培欣刘胜旺
- 关键词：新城疫病毒F基因基因亚型
- 雏番鸭细小病毒病研究进展
- 本文对近年来雏番鸭细小病毒的检测与诊断方法、分子流行病学、疫苗研究和防制等方面的研究进展进行了综述，并对番鸭细小病毒的研究方向做出展望。
- 李林林孙敏华董嘉文胡奇林
- 关键词：雏番鸭细小病毒分子流行病学
- 坦布苏病毒病研究进展被引量：3
- 2017年
- 坦布苏病毒病是一种新发传染病,可造成蛋鸭、种鸭产蛋骤降,肉鸭发育迟缓。给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。本文就坦布苏病毒病流行和防控的最新进展进行综述。
- 孙敏华
- 广东省发病猪禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分布被引量：3
- 2010年
- 为了解广东省发病猪、禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛(HPI)的分布和HPI阳性菌的血清型,从广东省发病的猪、禽养殖场共分离鉴定了608株大肠杆菌,针对耶尔森菌强毒力岛的标志基因irp2基因设计1对引物,对这些大肠杆菌进行了irp2基因的PCR检测;并对HPI阳性菌进行O血清型鉴定。结果显示,有105株菌含有irp2基因,即HPI阳性率为17.27%(105/608)。猪源、鹅源、鸽源、鸡源、鸭源、鹧鸪源大肠杆菌的HPI检出率分别是16.51%、17.81%、21.05%、17.74%、19.01%及0;105株HPI阳性菌的血清型分布较为分散,没有明显规律;主要的血清型有O1、O26、O45、O114、O136、O18等。研究表明,广东省猪、禽养殖场大肠杆菌的HPI携带率较高,血清型复杂。
- 吕殿红胡奇林周秀蓉孙敏华董嘉文
- 关键词：大肠杆菌血清型
