李丹怡
- 作品数：5 被引量：17H指数：3
- 供职机构：昆明医学院基础医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 中国西南阿昌族G6PD缺陷的特征及新单体型487G>A/IVS5-612(G>C)的鉴定被引量：4
- 2007年
- 探讨中国西南部疟疾高发区云南省梁河县阿昌族人群的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺陷的发生率及其分子特征. 四氮唑蓝纸片法和G6PD/6PGD活性测定筛查490阿昌族个体 （男260人, 女230人）, 发现男性G6PD缺陷的发生率为7.31% （19/260）; 女性为4.35 （10/230）. PCR-DHPLC-Sequencing 或PCR-Direct Sequencing分析19个阿昌族无关个体G6PD基因外显子2～13, G6PD Mahidol （487G＞A）的突变率为84.2% （16/19）; 所有G6PD Mahido均与新的多态性IVS5-612 （G＞C）连锁. G6PD 487G＞A/IVS5-612 （G＞C） 构成新的单体型成为这一阿昌族群体G6PD缺陷的分子特征之一, 已提交GenBank （登录号： EF190463）. 阿昌族G6PD Mahidol 的高发与缅甸人群G6PD Mahidol 突变率 （91.3%, 73/80） 极为相似, 这一结果提示阿昌族与缅甸人群之间有着广泛的基因交流 （gene flows）. 而中国其他少数民族最常见的突变G6PD Canton （1376G＞T） 和G6PD Kaiping （1388G＞A） 在这一阿昌族人群中没有找到, 提示阿昌族与其他少数民族的G6PD基因突变热点不同. 本研究数据是有关阿昌族G6PD遗传学的首次报道, 将为研究阿昌族起源、迁移提供线索并有助于上述地区疟疾的防治.
- 杨银峰朱月春李丹怡李治纲吕会茹吴静唐璟童淑芬
- 关键词：阿昌族G6PD基因突变
- 云南阿昌族G6PD基因突变G487A在DF213中的表达被引量：5
- 2007年
- 为获得阿昌族G6PDWT和G6PDG487A重组蛋白,研究G6PDG487A的结构和功能改变,从云南省德宏州梁河县杞木寨乡湾中村阿昌族聚集地的G6PD缺陷家系先证者和正常阿昌族个体全血提取RNA,经RT-巢式PCR得cDNA,将cDNA克隆至pMD18-Tsimple载体中并测序;错配碱基经定点突变修复后,目的基因亚克隆至pThioHis(A)载体,构建了阿昌族G6PD基因野生型和G487A突变型原核表达载体:pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A。用重组质粒转化E.coli Competent Cells DF213(G6PD defeciency),经IPTG诱导G6PD表达、10%SDS-PAGE电泳检测表达蛋白和紫外340nm定量测定G6PD活性的分析表明,pThioHis(A)-AChang-G6PDWT和pThioHis(A)-AChang-G6PDG487A在DF213中成功表达,分子量约为59kDa。IPTG诱导0、3、6、9、和12h后,G6PD活性逐渐增高,G6PD基因WT表达的酶活性约是G487A的20-25倍。表达载体的构建以及G6PDcDNA在DF213中成功表达,为重组酶G6PDG487A的进一步研究奠定了基础。
- 杨银峰朱月春李鸿钧李治纲吕会茹李丹怡崔映波冯维杨余果宇黄尤光
- 关键词：阿昌族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因
- 实时定量PCR测定人皮肤黑色素瘤细胞G6PD的表达
- 2007年
- 目的建立一种灵敏特异、重复性和稳定性好的检测G6PD表达的方法,以探究G6PD与肿瘤的相关性及其机理.方法用Real-time PCR技术测定了野生型、siRNA干扰型和无关序列对照型人皮肤黑色素瘤A375细胞的G6PD基因表达.绘制出β-actin和G6PD的标准曲线,标定了方法的稳定性和重复性,并以内参照β-actin较对G6PD的量.结果β-actin和G6PD标准曲线的回归系数分别为1.086和0.940;稳定性及重复性验证的Ctβ-actin值变异系数分别为2.46%和1.47%,而CtG6PD值变异系数分别为1.76%和1.87%.以野生型A375细胞作对照,无关序列不干扰A375细胞内源性G6PD基因表达(P>0.05),针对G6PD基因表达的siRNA的干扰效率为49%(P<0.01).结论实时荧光定量PCR在检测细胞G6PD基因表达时具有高灵敏度、高重复性和高稳定性的特点,可进一步用于G6PD与肿瘤的相关性研究.
- 朱月春李丹怡吕会茹杨银峰童淑芬
- 关键词：A375细胞G6PD
- siRNA沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及凋亡的影响被引量：7
- 2008年
- 研究表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与肿瘤的发生、发展、临床表型及治疗和预后有关.为阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理,针对人G6PD基因设计3条siRNA和一条无关序列,再据每一序列,合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-U6.2/Lenti连接,转染人皮肤黑色素瘤A375细胞,Real-timePCR筛选有效的一条siRNA,经病毒颗粒包装和病毒生产并感染A375细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,Western blotting检测siRNA干扰G6PD效率为88.83%,构建成G6PD缺陷型A375稳转细胞(A375-G6PD!).与野生型A375细胞(A375-WT)比较,A375-G6PD!的G6PD活性仅为21.53%,细胞倍增时间延长,增殖被抑制,克隆形成率降低25%(P<0.05),凋亡细胞数增加2.86倍(P<0.01),SPF增加33.8%(P<0.05),PI增加59.7%(P<0.01),G0/G1期下降27.7%(P<0.01),凋亡相关蛋白P53下降54.7%(P<0.01)、Caspase-3增加2.2倍(P<0.01)和Bcl-2降低21.7%(P>0.05),提示,G6PD缺陷可能通过下调P53蛋白表达和上调Caspase-3的表达,抑制G2/M期向G0/G1期转换的进程,促进A375的凋亡,机理有待于进一步探讨.
- 朱月春吕会茹李丹怡童淑芬
- 关键词：SIRNA干扰葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
- 沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及抗氧化应激的影响(摘要)被引量：1
- 2010年
- 目的鉴定G6PD缺陷型人皮肤黑色素瘤稳转细胞株;观察其生长增殖及对Diamide、H2O2或UV诱导的氧化应激反应;比较与外源性抑制G6PD剂作用的异同;探讨G6PD与肿瘤细胞生长和抗氧化应激的关系.方法通过荧光显微镜观察GFP表达的稳定性、Western blotting检测G6PD蛋白表达量和紫外法测定G6PD比活性,以鉴定G6PD缺陷型人皮肤黑色素瘤A375稳转细胞株(A375-G6PD△);MTT法、平板克隆法和流式细胞仪(FCM)检测观察A375-G6PD△与野生细胞(A375-WT)生长增殖能力和凋亡率的差异;比较两种细胞对巯基氧化剂二酰胺(Diamide)处理后细胞存活率以及NADPH、GSH和H2O2指标的改变;通过FCM对比Diamide、H2O2或UV处理前后A375-G6PD△和A375-WT细胞凋亡率和凋亡蛋白(P53、Bcl-2、Casepase-3)的变化;并观察G6PD非竞争抑制剂DHEA协同Diamide作用与Diamide单独作用相比,两种细胞抗氧化能力和凋亡结果的异同.结果通过反复冻存及多次传代,A375-G6PD△的GFP荧光表达稳定,与A375-WT相比,G6PD表达降低了88.8%,比活性减少了78.5%;A375-G6PD△的生长速度比A375-WT减慢了24.4～37.5%,单细胞克隆形成率也降低25%,凋亡率增加了40%;A375-G6PD△和A375-WT的Diamide半致死量分别为1.2mM和1.8mM;用1.8mMDiamide处理后,与A375-WT相比,A375-G6PD△的NADPH和GSH下降了2.4倍和8.8倍,H2O2增加了7.3倍;FCM检测的凋亡结果显示,A375-G6PD△在Diamide、H2O2或UV作用后,较A375-WT的凋亡率增加了1.8倍、1.7倍和1.1倍;与A375-WT相比,A375-G6PD△在Diamide处理后P53下降2.3倍、Casepase-3升高2.5倍,而在UV作用后P53增加1.4倍;两种细胞Bcl-2的水平在Diamide、H2O2和UV作用后均有所下调;此外,DHEA对A375-G6PD△和A375-WT的G6PD比活性的抑制程度相近,在Diamide联合DHEA的作用后的凋亡数值也相似,二者的P53表达均降低约60%、Casepase-3增加近1倍.结论 A375-G6PD△是稳转的G6PD缺陷人皮肤黑色素瘤细胞株;沉默G6PD表达可减慢A375细胞生长增殖
- 李丹怡朱月春
- 关键词：G6PD氧化应激
