何昆
- 作品数：3 被引量：9H指数：2
- 供职机构：东北农业大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：博士科研启动基金黑龙江省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 快速筛选高水平稳定表达成纤维细胞生长因子-21真核细胞株新方法的建立被引量：1
- 2012年
- 成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员,其研究已成为世界糖尿病研究的新热点,并有望成为治疗2型糖尿病的新型药物.然而,应用真核表达系统,更加快速、高效生产更接近天然状态的FGF-21蛋白并对其生物学功能进行的研究,至今尚未报道,因此建立高效稳定的FGF-21真核表达系统至关重要.本研究以FGF-21为目的基因,利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,分别构建了单基因表达载体Pee12.4-FGF-21-Pee6.4-EGFP(Peedual)、Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP(PeeIRES)和双基因的真核表达载体Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP-Pee6.4-FGF-21(Peedual-IRES),分别转染CHO-K1SV细胞后,通过GS加压和流式细胞术(在488 nm波长的激发光下能检测到EGFP绿色荧光)双筛选系统快速有效获得了稳定高效表达目的蛋白的细胞系.应用SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测细胞系目的蛋白的表达及差异,并通过HepG-2细胞糖吸收模型进行蛋白活性检测.研究结果表明:两个筛选系统结合使用,更好更快地筛选到了稳定转染并高效表达目的蛋白的细胞系,而且与单基因的载体相比,双基因载体Peedual-IRES在操作条件一致的情况下,目的蛋白表达量显著提高且均具有生物活性.本研究建立了省时、高效的真核表达平台,为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法.
- 张雅坤王文飞何昆叶贤龙刘淼韩苗苗刘铭瑶李德山
- 关键词：真核表达流式细胞术FGF-21
- 精氨酸修饰成纤维细胞生长因子21及修饰后蛋白体内稳定性和糖代谢调节作用的研究被引量：2
- 2012年
- 成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor21,FGF21)是2000年发现的一个不依赖胰岛素调节血糖的细胞因子,有望成为治疗糖尿病的候选药物.但是,野生型FGF21由于半衰期较短,在体内不稳定,从而影响其成药性.为提高FGF21的稳定性,本实验在FGF21的C端添加了2个精氨酸(arginine,Arg),命名为FGF21-2A,用Compute pI/Mw软件计算之后,等电点(isoelectric point,pI)从5.43上升到5.84,随后进行了蛋白质的表达、分离纯化、体内稳定性及糖代谢调节作用的研究.诱导表达后菌液的SDS-PAGE图经BandScan5.0分析后显示FGF21-2A的表达量相对于野生型FGF21提高了10.6%.家兔体内半衰期检测实验结果显示FGF21-2A的半衰期显著延长.GOD-POD法检测HepG2肝癌细胞葡萄糖吸收实验、糖尿病小鼠降血糖实验和肝糖原检测实验的结果证明,FGF21-2A的降糖效果得到了增强,并且持续时间相对于野生型FGF21显著延长.Real-time PCR结果发现,长期注射FGF21-2A显著提高了糖尿病小鼠肝脏内葡萄糖转运蛋白(GLUT)1和葡萄糖激酶(GK)mRNA的表达量,降低了葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)的mRNA表达量,表明FGF21-2A调节糖代谢的机制与野生型FGF21一致.综上所述,精氨酸修饰的FGF21其蛋白质稳定性提高,进而增加了对血糖的调控效果,有望成为新型糖尿病药物.
- 何昆张雅坤叶贤龙王文飞陈睿刘铭瑶冯明芳许嘉玲李德山
- 关键词：精氨酸
- FGF21基因优化及其生物活性研究被引量：6
- 2012年
- 成纤维细胞生长因子21(FGF21)是FGF家族的一员,它具有独立、安全以及有效地调节生物体内血糖水平的能力。为了提高FGF21蛋白的活性,将人FGF21(hFGF21)与鼠FGF21(mFGF21)的功能区互换,构建了一种新的FGF21基因(命名为hmFGF21)。通过基因重组的方法构建SUMO-hmFGF21表达载体后,转化大肠杆菌Rosetta中诱导表达。对融合蛋白进行纯化和酶切,获得的hmFGF21突变体纯度在95%以上,并在细胞水平和动物水平上检测了突变体的生物学活性。结果表明,与野生型hFGF21相比,相同菌量hmFGF21可溶性蛋白表达量提高了约2倍。人肝细胞模型HepG2的糖吸收实验显示,hmFGF21的葡萄糖吸收显著优于野生型hFGF21。2型糖尿病动物速效降糖实验和长效降糖实验表明,hmFGF21的降糖效果显著优于野生型hFGF21。这些结果说明,野生型hFGF21经优化改造后显著提高了其生物学活性。
- 叶贤龙高华山王文飞任桂萍刘明瑶何昆张雅坤赵景壮于丹李德山
- 关键词：葡萄糖吸收2型糖尿病
