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应用巢式PCR检测隐孢子虫被引量：9: 2010年; 应用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)建立了一种检测隐孢子虫(Cryptosporidium)的方法。试验中隐孢子虫卵囊纯化采用庶糖密度梯度离心法,以液氮-热水浴反复冻融及酚-氯仿抽提冷乙醇沉淀法制备模板DNA,根据隐孢子虫18S rRNA序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法。该方法特异性强,可检出牛源微小隐孢子虫(C.parvum)、羊源微小隐孢子虫(C.parvum)、牛源安氏隐孢子虫(C.andersoni)、鸡源贝氏隐孢子虫(C.baileyi)及猪源隐孢子虫(C.suis);敏感性高,该方法最低核酸DNA检测量达到10fg。初步应用结果表明,所建立的Nested PCR方法适合于隐孢子虫病的诊断和分子流行病学调查。; 李巍吴康张西臣李建华张国才李淑红宫鹏涛杨举; 关键词：隐孢子虫 PCR

微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21的原核表达及鉴定: 2011年; 本研究旨在克隆微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21开放阅读框,构建其原核表达质粒,并对获得的融合蛋白进行鉴定。从含CP21基因的噬菌体中提取模板DNA,PCR扩增基因片段,构建pET-28a-CP21原核表达质粒,转化至埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。用原核表达蛋白免疫小鼠,制备抗重组蛋白多抗,对蛋白进行定位。结果表明成功扩增出CP21基因,并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌中表达出相对分子质量为25 ku的融合蛋白,Western blotting证明表达的CP21融合蛋白能与抗C.parvum多克隆抗体产生特异性反应。免疫荧光结果表明:CP21基因在子孢子和卵囊期均表达,且表达产物位于子孢子表膜和卵囊壁表面。CP21是一种与侵入机制有关的黏附相关蛋白。研究结果为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制奠定了基础。; 任保彦陈玉兰宫鹏涛李巍李建华苏利波李赫杨举刁玉梅张西臣; 关键词：微小隐孢子虫原核表达免疫荧光定位

伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR鉴别检测方法的建立: 2011年; 目的建立伊氏锥虫和路氏锥虫二重PCR鉴别检测方法。方法根据路氏锥虫18S rRNA基因和伊氏锥虫RoTat 1.2VSG基因特异序列设计两对引物,通过优化PCR反应体系与反应条件,建立种特异二重PCR鉴别检测方法。结果用建立的二重PCR鉴别检测方法能特异扩增路氏锥虫和伊氏锥虫目的片段,大小分别为261bp和482bp;路氏锥虫和伊氏锥虫的最低检出量分别均达1个虫体,检测日本血吸虫、杜氏利氏曼原虫与瑟氏泰勒虫等其他血液寄生虫均为阴性。结论建立的二重PCR检测体系灵敏度高、特异性强,适用于路氏锥虫和伊氏锥虫的感染检测及流行病学调查。; 王泽东刘畅范大为李巍苏利波宫鹏涛李建华李赫张国才张西臣; 关键词：伊氏锥虫 PCR检测

应用巢式PCR-RFLP方法鉴别我国常见的几种隐孢子虫被引量：5: 2011年; 应用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)—限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法对微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、贝氏隐孢子虫(C.baileyi)和猪隐孢子虫(C.suis)的鉴别进行了研究。结果显示:牛源C.parvum、羊源C.parvum、C.suis、C.andersoni和C.baileyi扩增产物片段大小分别为212,213,213,213,210 bp;扩增产物先后经TaqⅠ、BstUⅠ与MseⅠ酶切,根据酶切后形成的不同酶切图谱可以鉴别C.parvum、C.suis、C.andersoni和C.baileyi。该研究为我国隐孢子虫的分类和隐孢子虫病的分子流行病学调查提供了新的方法。; 李巍张西臣李建华李淑红宫鹏涛杨举; 关键词：隐孢子虫

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体检测ELISA方法的建立被引量：1: 2011年; 为建立快捷的含病毒隐孢子虫的检测方法,本研究利用已构建的微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白重组表达质粒表达并纯化重组蛋白,建立以该重组衣壳蛋白为包被抗原检测抗体的间接ELISA检测方法。经优化后间接ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为0.25μg/孔,被检血清稀释度为1∶200,酶标二抗稀释度为1∶2000,封闭液为含5%脱脂奶粉的PBST溶液。该方法检测安氏隐孢子虫阳性血清,柔嫩艾美尔球虫阳性血清,蓝氏贾第虫阳性血清,弓形虫阳性血清与微小隐孢子虫阳性结果均为阴性。该方法灵敏度为1∶1600,特异性较强且具可重复性,可用于含病毒隐孢子虫的抗体检测及流行病学调查。; 刁玉梅宫鹏涛李巍苏利波黄祥盛高华义李赫胡进平李建华张西臣; 关键词：微小隐孢子虫衣壳蛋白间接ELISA

五株隐孢子虫18S rRNA部分基因克隆和序列分析: 2010年; 设计Nested PCR引物扩增牛源微小隐孢子虫Cryptospordium parvum、羊源微小隐孢子虫C. parvum、牛源安氏隐孢子虫C. andersoni、鸡源贝氏隐孢子虫C. baileyi及猪源隐孢子虫C. suis 18S rRNA基因突变区,PCR产物经克隆测序,其片段大小分别为212、213、213、213和210 bp.将测得的序列用DNAStar软件分析并与NCBI数据库中相同与相近种株序列进行相似性比较, 进行相似性分析并用TREECON软件绘制系统发育进化树.结果表明测得的5株隐孢子虫与各自相同种相似性为98.1%～100%,与其他种相似性为90.1%～98.6%.分析显示在此突变区设置特异酶切位点能区分开C. parvum, C. andersoni, C. baileyi与C. suis,位点分别是TaqI、BstUI、MseI.本研究为我国隐孢子虫分类、分子流行病学研究提供了新的方法.; 于师宇李巍宫鹏涛张西臣李建华李春雨苏利波刁玉梅; 关键词：微小隐孢子虫 RRNA

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定: 2011年; 目的对微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因进行克隆、表达和反应原性分析。方法以微小隐孢子虫总RNA逆转录的cDNA为模板,克隆S-dsRNA基因,并转化至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET-28a(+)-S,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与鼠抗微小隐孢子虫阳性血清的反应原性。结果 PCR和双酶切鉴定表明,重组质粒pET-28a(+)-S构建成功。SDS-PAGE结果显示,37℃下经1mmol/L IPTG诱导4h,重组蛋白表达量最大。重组蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为37000,与预期大小一致,重组蛋白约占蛋白总量的72.6%。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能识别抗微小隐孢子虫阳性鼠血清。结论微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白S-dsRNA基因表达成功,重组蛋白具有反应原性。; 刁玉梅宫鹏涛李巍苏利波黄祥盛李建华张西臣; 关键词：微小隐孢子虫原核表达

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李巍