余昆
- 作品数：5 被引量：6H指数：1
- 供职机构：重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 小鼠survivin基因慢病毒表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2011年
- 背景:间充质干细胞体内有限的存活能力严重制约其用于体内治疗方面的应用,因此寻找一种能延长存活能力的实验方法是间充质干细胞进行体内实验的重要前提。目的:应用pLV.Des3d.P/hygro构建小鼠survivin基因的慢病毒表达载体。方法:采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivinmRNA序列进行分析,设计一对survivin基因上下游引物,利用Gateway克隆方法,分别在其两端添加attB重组位点,运用PCR扩增mSurvivin和IRES/EmGFP,将PCR产物进行BP反应然后转化到Stbl3感受态菌,通过卡那霉素抗性筛选、PCR鉴定,选取鉴定正确的pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP克隆测序。将pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP与pLV.Des3d.P/hygro混合进行LR反应,构建慢病毒载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP,再次进行PCR、测序的鉴定。结果与结论:显示基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组慢病毒表达载体。说明慢病毒表达载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP构建成功,为下一步研究survivin在间充质干细胞中抗凋亡作用奠定基础。
- 杨平苟欣周青松何卫阳余昆
- 关键词：骨髓间充质干细胞病毒SURVIVIN小鼠
- 小鼠髓源性树突状细胞的体外扩增及生物学特性的鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的以小鼠骨髓细胞为前体,建立一种高效、简便的体外扩增、分离培养树突状细胞(DC)的方法。方法实验分为GM/4组和GM/4-α组,以重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组鼠白介素-4(rmIL-4)对小鼠骨髓细胞联合诱导培养,GM/4-α组在第5天添加rmTNF-α继续培养48 h,GM/4组不加并于第5天时终止培养;分别收集第5天、第7天的悬浮及疏松贴壁细胞,扫描电镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面分子,同种异体混合淋巴细胞反应(MLR),检测2组细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果所收集的2组细胞均具有典型DC形态,细胞表面高表达小鼠髓源性DC相对特异性标志CD11c,表达率达75%以上;GM/4组DC细胞表面CD40、CD86、MHC-Ⅱ的表达率分别为30.5%、34.2%、45.1%,GM/4-α组则分别为78.7%、88.3%、96.7%;MIR中GM/4组DC刺激同种异体T细胞活化增殖的能力不如GM/4-α组强。结论此种方法能于体外定向诱导和扩增出大量髓源性DC,这为后续研究DC在器官移植后诱导机体免疫耐受的机制奠定了基础。
- 余昆苟欣周青松杨华安仲伟营夏阳
- 关键词：树突细胞免疫耐受小鼠
- Survivin在小鼠髓源性树突状细胞不同分化阶段中的差异性表达被引量：1
- 2010年
- 目的:探讨不同分化阶段的树突状细胞(DC)sur-vivin的差异性表达。方法:制备骨髓细胞作为DC前体,以rmGM-CSF联合rmIL-4对前体细胞诱导培养,第5天时添加rmTNF-α继续孵育48 h以进一步刺激DC分化成熟。分别收集0、5、7 d的细胞(其中第5天的细胞为添加rmTNF-α前收集),扫描电镜观察DC形态、流式细胞术鉴定DC表型,RT-PCR、Western blot检测不同分化阶段DCsurvivin的表达。结果:扫描电镜下不同分化阶段的细胞均具有典型DC形态;流式细胞术分析表明,不同成熟阶段的DC均高表达小鼠髓源性DC相对特异性标志CD11c,经rmTNF-α刺激后的DC其细胞表面CD40、CD86、MHC-Ⅱ等分子呈高水平表达;RT-PCR、Western blot检测结果显示,随着DC的分化成熟,sur-vivinmRNA及蛋白的表达水平呈上升趋势。结论:不同诱导条件下,获得的DCsurvivin表达有差别,随着DC成熟,sur-vivin表达增加。
- 余昆苟欣杨华安周青松仲伟营郑军
- 关键词：SURVIVIN树突状细胞免疫耐受骨髓
- 小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的:应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法:采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果:双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论:重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。
- 余昆苟欣杨华安周青松夏阳
- 关键词：SURVIVINPEGFP-N1未成熟树突状细胞
- 树突状细胞诱导的器官移植后免疫耐受被引量：1
- 2009年
- 树突状细胞(dendritic cell,DC)是当前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC),其作为机体适应性T细胞免疫应答的始动者和调控者,已成为目前器官移植领域的研究热点。本文就树突状细胞的生物学特性、体外扩增培养、诱导移植免疫耐受的机制等方面的研究进展做一综述。
- 余昆苟欣
- 关键词：树突状细胞器官移植免疫耐受
