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全骨髓细胞贴壁法分离与培养大鼠骨髓间充质干细胞的多向分化能力被引量：7: 2012年; 背景:分离培养纯度较高的骨髓间充质干细胞是对其进行深入研究的前提。目的:观察全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征。方法:选取体质量为80-100g雄性SD大鼠,采用全骨髓细胞贴壁培养法获取骨髓间充质干细胞。在取材过程中需严格掌握大鼠处死至将细胞悬液放入培养箱内的时间,一般控制在40min以内。使用基础培养基冲洗骨髓腔时力度适中且在骨髓腔内旋转数次,可使骨髓细胞充分脱落,保证骨髓细胞的获得量。结果与结论:原代骨髓间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列;第3代骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形,经历3个生长时期:潜伏期、对数生长期和停滞期;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原结果示:CD29+99.45%、CD34+1.45%、CD44+99.52%、CD45+1.41%;成骨、成脂诱导分化后,矿化结节被茜素红染成橘红色,脂滴被油红O染成红色。说明骨髓间充质干细胞能向成骨、成脂分化,具有多向分化潜能,符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定动物来源骨髓间充质干细胞的最低标准。; 张君红姜海行覃山羽孟云超宁琳; 关键词：骨髓间充质干细胞成脂分化表面抗原细胞形态

应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5 mRNA表达被引量：3: 2012年; 目的应用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠肝星状细胞(HSCs)的死亡受体5(DR5)mRNA表达的影响,探讨BMSCs诱导HSCs凋亡及其机制。方法采用贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠BMSCs,传至第4代使用;大鼠原代HSCs细胞及肝纤维原细胞系冻融后传代使用。应用6孔塑料培养板,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。实验分为3组:(1)实验组:BMSCs与HSCs共培养;(2)空白对照组:HSCs单独培养;(3)阴性对照组:大鼠肝纤维原细胞与HSCs共培养。以上培养体系动态观察24、48、72h,应用流式细胞仪检测HSCs细胞凋亡率,采用SYBR Green I荧光实时定量RT-PCR法检测,以β-actin基因作为内参,计算各组DR5mRNA的相对表达量。结果在共培养组中,BMSCs促进了HSCs凋亡,与其他两组比较差异有显著统计学意义(P<0.01),空白对照组与阴性对照组比较无统计学意义(P>0.05)。实验组BMSCs能明显上调HSCs中DR5mRNA的表达,与空白对照组和阴性对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.01);空白对照组与阴性对照组DR5mRNA的表达比较无统计学意义(P>0.05)。结论利用SYBR荧光实时定量RT-PCR法检测BMSCs诱导大鼠肝星状细胞中DR5mRNA表达,为进一步研究BMSCs通过死亡受体途径调控HSCs凋亡以及为BMSCs用于治疗肝纤维化的机制研究提供了理论基础。; 杨文覃山羽姜海行张君红宁琳孟云超

肝细胞生长因子在TRAIL促进原代肝星状细胞凋亡中的作用被引量：3: 2013年; 目的观察肝细胞生长因子（HGF）在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）促进原代星状细胞（HSCs）凋亡中的作用及机制。方法复苏、传代SD大鼠原代HSCs，细胞增殖明显时用于实验。分为4组：①HSCs空白对照组；②HGF组；③TRAIL组；④HGF组＋TRAIL组。各实验组细胞培养24h、48h。采用倒置相差显微镜观察细胞形态，MTr比色法检测外源性HGF及TRAIL分别对肝星状细胞增殖抑制率的影响。流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法检测HSCs凋亡以及使用Western印迹法检测HSCs表面DtL5蛋白的表达。结果MTT法结果显示HGF及TRAIL分别在50～200ng/ml、0．5～1．5μg/ml浓度下对HSCs增殖抑制率无影响，TRAIL在2μg/ml浓度下对HSCs有抑制作用；24、48h增殖抑制率分别为（8_03±1．2）％、（24．6±0．8）％（P〈0．01）。流式细胞仪检测各组HSCs的凋亡结果示：HGF＋TRAIL组24、48h凋亡率及DIL5蛋白相对表达量明显高于空白对照组、TRAIL组及HGF组（均P〈0．01）。结论HGF能促进TRAIL诱导HSCs的凋亡并抑制其增殖，可能与HGF上调活化HSCs表面DR5蛋白表达有关。; 张君红姜海行覃山羽孟云超宁琳杨文沈妍华; 关键词：肝星状细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体肝细胞生长因子凋亡

骨髓间充质干细胞体外调控肝星状细胞死亡受体5的表达被引量：6: 2012年; 背景:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体可以通过上调死亡受体5蛋白的表达诱导大鼠肝星状细胞凋亡。目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞死亡受体5和Caspase-3蛋白表达的影响,探讨骨髓间充质干细胞诱导肝星状细胞凋亡及其机制。方法:贴壁筛选法培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代使用;大鼠原代肝星状细胞和肝纤维原细胞系冻融后传代使用。应用6孔培养板,建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。将细胞分为4组:①空白对照组:肝星状细胞和骨髓间充质干细胞分别单独培养。②阴性对照组:肝纤维原细胞与肝星状细胞共培养(模拟星状细胞体内生长环境)。③骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养组。④实验组:1.5mg/LTRAIL多克隆抗体与骨髓间充质干细胞作用6h后,不换液,再与肝星状细胞共培养。结果与结论:在共培养组中肝星状细胞的增殖降低,凋亡增加,且肝星状细胞死亡受体5、Caspase-3蛋白的表达均显著升高,并呈时间依赖性,且与其他组比较差异有显著性意义(P<0.01)。实验组Caspase-3和死亡受体5蛋白的表达在共培养的各个时间段均低于共培养组,与共培养组比较差异有显著性意义(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养能抑制肝星状细胞的增殖,促进肝星状细胞的凋亡,其机制可能为骨髓间充质干细胞旁分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体通过上调Caspase-3和死亡受体5蛋白的表达实现的。; 杨文覃山羽姜海行张君红宁琳孟云超; 关键词：死亡受体5 骨髓间充质干细胞肝星状细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体

肝细胞生长因子的激活诱导肝星状细胞凋亡被引量：6: 2012年; 目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）与肝星状细胞（HSCs）共培养体系中肝细胞生长因子激活因子（HGFA）激活肝细胞生长因子（HGF）后对HSCs凋亡的影响。方法用半透膜建立上下双层细胞共培养体系，各组培养24h、48h及72h后，倒置相差显微镜观察细胞形态学变化，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原及HSCs凋亡率；四甲基偶氮唑盐法检测HSCs增殖率，免疫组织化学法检测HSCs中α-平滑肌肌动蛋白表达；免疫荧光及组织化学染色法检测HGF的激活形式（即HGF-α链）；酶联免疫吸附法检测HGF及HGFA浓度。计量资料采用单因素方差分析，组间均数的比较采用口检验。结果不同浓度HGF在各时段对HSCs无增殖抑制作用（P〉0．05），差异无统计学意义；HGFA在各时段对HSCs有明显增殖抑制作用，且呈浓度依赖陛，在24hHGFA浓度为70ng／ml时抑制作用为（0．26±0．00），较对照组的（0．13±0．04），明显增加，差异有统计学意义（P〈0．05）；72h实验组HGF-α链相对表达量37．24±1．03低于HGFA干预组的40．44±0．77，差异有统计学意义（P〈0．05）；两者在各时段与对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。实验组HSCs凋亡率在72h为40．77％±1．16％，均较HGFA干预组的33．35％±2．04%高，差异有统计学意义（P〈0．05），两者在各时段与对照组比较，差异有统计学意义护〈0．05）。实验组及HGFA干预组中HGF浓度的降低呈时间依赖性，较HSCs空白对照组低；实验组HGFA的浓度在各时段均较对照组高。结论BMSCs与HSCs共培养后促进HGFA的分泌，并激活HGF使其发挥促HSCs凋亡的作用。; 孟云超姜海行张君红陆正峰覃山羽宁琳杨文; 关键词：间质干细胞骨髓肝星状细胞细胞凋亡肝细胞生长因子

肝细胞生长因子在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下对原代肝星状细胞增殖及凋亡的影响: 2012年; 背景:活化的肝星状细胞是肝纤维化的关键因素,研究表明肝细胞生长因子能促进星状细胞凋亡,其具体机制可能与增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导星状细胞凋亡有关。目的:观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体作用下,肝细胞生长因子对原代肝星状细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其可能机制。方法:将SD大鼠原代肝星状细胞复苏、传代,细胞增殖明显时用于实验。实验分为4组:空白对照组为单纯肝星状细胞培养;肝细胞生长因子组:将100μg/L肝细胞生长因子作用于肝星状细胞;TRAIL组:将2mg/L的TRAIL作用于肝星状细胞;肝细胞生长因子+TRAIL组:将肝细胞生长因子预先刺激肝星状细胞24h,再加入2mg/LTRAIL。结果与结论:MTT检测显示肝细胞生长因子及TRAIL分别在50～200μg/L、0.5～1.5mg/L各浓度下对肝星状细胞增殖抑制率无影响,TRAIL在2mg/L作用下对肝星状细胞有抑制作用。流式细胞仪检测肝细胞生长因子+TRAIL组的中晚期凋亡率明显高于空白对照组及肝细胞生长因子组(P<0.05);肝细胞生长因子+TRAIL组DR5荧光强度明显高于其他3组(P<0.01)。提示在TRAIL作用下,肝细胞生长因子能促进肝星状细胞的凋亡、抑制其增殖。可能与肝细胞生长因子上调活化肝星状细胞表面DR5表达有关。; 张君红姜海行覃山羽陆正峰孟云超宁琳杨文; 关键词：肝星状细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体肝细胞生长因子凋亡死亡受体5

骨髓充质干细胞调控尿激酶型纤溶酶原激活物表达及其对大鼠肝星状细胞凋亡的影响被引量：2: 2012年; 背景:骨髓间充质干细胞主要通过旁分泌及激活肝细胞生长因子促进肝星状细胞凋亡。目的:观察骨髓间充质干细胞对尿激酶型纤溶酶原激活物合成的调控及肝细胞生长因子活性的影响,探讨其诱导肝星状细胞凋亡的机制。方法:实验分为5组:①共培养组:大鼠骨髓间充质干细胞与肝星状细胞建立上下双层细胞共培养体系。②肝星状细胞单独培养组。③纤维原细胞对照组。④UK122干预组:在骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养6h前加入尿激酶型纤溶酶原激活物特异性抑制剂UK122。⑤骨髓间充质干细胞空白对照组。结果与结论:共培养组尿激酶型纤溶酶原激活物mRNA表达较肝星状细胞单独培养明显增加(P<0.01)。与肝星状细胞单独培养相比,共培养组的肝星状细胞在与骨髓间充质干细胞共培养24h后表现明显增殖抑制(P<0.01),且呈现时间依赖性;骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养后,活性肝细胞生长因子的蛋白表达及肝星状细胞凋亡增加(P<0.01)。UK122干预后活性肝细胞生长因子表达及肝星状细胞凋亡减少(P<0.01)。提示骨髓间充质干细胞通过促进分泌尿激酶型纤溶酶原激活物,增加活性肝细胞生长因子表达,促进肝星状细胞凋亡。; 宁琳姜海行覃山羽张君红杨文孟云超; 关键词：肝星状细胞骨髓间充质干细胞凋亡肝细胞生长因子尿激酶型纤溶酶原激活物

大鼠骨髓间充质干细胞旁分泌HGF上调肝星状细胞DR5及caspase-8的表达被引量：5: 2012年; 目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)旁分泌肝细胞生长因子(HGF)对肝星状细胞(HSCs)死亡受体-5(DR5)及caspase-8的影响。方法应用6孔培养板建立双层细胞共培养体系,分A组:对照组;B组:共培养组;C组:TNF-α预处理组;D组:HGF-ShRNA干扰组。ELISA法检测上清液中HGF及TRAIL的浓度;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;荧光定量-PCR、Western blot分别检测DR5、caspase-8 mRNA和蛋白的表达。结果 1)TNF-α预处理组中HGF的浓度明显高于BMSCs组及对照组(P<0.01);BMSCs组中TRAIL的浓度明显高于其他3组(P<0.01)。2)TNF-α预处理组中HSCs凋亡率明显高于其他3组且呈时间依赖性(P<0.01);HGF-ShRNA干扰组中HSCs的凋亡率低于共培养组,高于对照组(P<0.01)。3)共培养组及TNF-α预处理组DR5、caspase-8 mRNA及蛋白表达量明显高于对照组及HGF-ShRNA干扰组(P<0.01)。结论 BMSCs旁分泌HGF能上调DR5及caspase-8的表达促进HSCs的凋亡。; 张君红姜海行孟云超宁琳杨文沈妍华韦柳萍; 关键词：骨髓间充质干细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体

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