高荣凯
- 作品数：68 被引量：205H指数：9
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- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划军队医学科研项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株的构建
- 2008年
- 目的利用λ噬菌体Red重组酶系统,构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株。方法采用PCR方法,将完整的噬菌体基因Ⅲ和氯霉素抗性基因拼接,使其两端带有与四环素基因同源的36nt序列;利用λ噬菌体Red重组酶系统,将其整合到大肠杆菌XL1-Blue的附加体上,以替换掉四环素基因,经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,获得包装菌株XLe-pⅢ;将基因Ⅲ缺失的噬菌体基因组导入包装菌株,制备缺陷型辅助噬菌体,集落形成试验检测缺陷噬菌体的感染能力。结果所构建的包装菌株XLe-pⅢ经氯霉素抗性筛选及PCR鉴定,证明氯霉素抗性基因已与噬菌体基因Ⅲ一同整合到附加体上,重组菌不能在含有氨苄西林的LB培养基中生长,仍保留四环素抗性;该包装菌株能用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体,制备的缺陷型辅助噬菌体的滴度为3.0×108。结论利用λ噬菌体Red重组酶系统,已成功构建用于制备基因Ⅲ缺失的辅助噬菌体的包装菌株,以其制备的缺陷型辅助噬菌体有望用于常规筛选或SIP体系。
- 高荣凯王芃王琰
- 关键词：Λ噬菌体辅助噬菌体
- 免疫捕捉PCR技术及其应用被引量：5
- 2006年
- 通过免疫捕捉结合PCR扩增来检测微量抗原的方法称为免疫捕捉PCR,它的检测对象是完整的病原体,具有非常高的特异性和敏感性,在传染病的诊断、流行病学调查以及环境微生物的检测等诸多领域有着广阔的应用前景。
- 高荣凯苏国富
- 关键词：PCR病原体病毒
- 基因治疗中的动物病毒载体
- 1996年
- 基因治疗是新近发展起来的一种新治疗技术,有着广阔的应用前景,它的迅猛发展与真核细胞基因转移技术的发展密切相关.目前常用的基因转移技术主要有:①病毒方法:包括RNA病毒和DNA病毒载体;②化学方法:如磷酸钙共沉淀法;③膜融合的方法:即利用包被着DNA分子的膜性载体,如脂质体、红细胞膜、原生质体等;
- 高荣凯王琰肖红
- 关键词：基因治疗病毒载体逆转录病毒
- 大肠杆菌CS3菌毛作为表面表达载体的改建
- 1999年
- 高荣凯张兆山李淑琴
- 关键词：肠毒素性大肠杆菌基因工程疫苗工程研究蛋白二级结构生物吸附剂
- 抗银环蛇毒素人源单链抗体的筛选及鉴定被引量：3
- 2010年
- 目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗银环蛇毒素的人源单链抗体(ScFv),并进行鉴定。方法以银环蛇毒素为靶抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性抗体,采用ELISA法检测其结合活性;与抗蛇毒素马血清进行竞争抑制ELISA,检测其中和活性;DNA指纹图谱分析和序列测定确定其抗体类型。结果经4轮筛选,获得了5株对银环蛇毒素具有结合活性的阳性克隆;其中1株结合活性高的单克隆抗体中和活性抑制率可达8.5%;DNA指纹图谱显示为3个不同的ScFv基因,序列分析表明其重链可变区均属于VHⅠ型,轻链可变区分别为VκⅡ、VκⅢ和VλⅡ。结论利用噬菌体抗体库技术获得了具有中和活性的抗银环蛇毒素人源单链抗体。
- 王欲晓周丽君张海荣曲佳乔媛媛赵晓航高荣凯
- 关键词：细菌噬菌体抗体
- 蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素融合蛋白表达质粒的构建及表达
- 2011年
- 目的构建适合选择感染性噬菌体(Selectivelyinfectivephage,SIP)技术筛选的蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素(α-Bungarotox-ins,α-BTXs)融合蛋白表达质粒。方法从银环蛇毒腺中提取总RNA,RT-PCR扩增α-BTXs基因,插入表达载体pTTMIN,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE、Western blot及竞争抑制ELISA法检测融合蛋白的表达。结果获得的α-BTXs基因序列与相关报道完全一致;融合蛋白表达质粒构建正确;融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白的20%,可与抗蛇毒素血清发生特异性反应,且保持了α-BTXs的抗原性。结论成功构建了蛋白Ⅲ-α-BTXs融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白,为利用SIP技术筛选抗α-BTXs人源抗体奠定了基础。
- 高荣凯王欲晓张海荣周丽君曲佳
- 关键词：Α-银环蛇毒素重组融合蛋白质类
- 选择感染性噬菌体技术及应用被引量：1
- 2008年
- 选择感染性噬菌体技术是在传统噬菌体表面展示技术的基础上发展而来的一种新方法,通过将噬菌体感染力的恢复与蛋白间的相互作用偶联起来进行筛选,有效提高了筛选效率,简化了操作过程,降低了本底,为后基因组学的研究提供了便利方法,特别是体内法在理论上适合于库-库筛选,更具有应用价值。
- 高荣凯赵晓航王琰
- 关键词：噬菌体表面展示
- 采用Red重组系统构建包装菌株DH-gIII被引量：1
- 2008年
- 选择感染性噬菌体技术是研究蛋白相互作用的良好手段,获得基因III缺陷的辅助噬菌体是构成SIP体系的关键。为制备基因III缺失的辅助噬菌体,利用λRed重组系统将完整的噬菌体基因III和氯霉素抗性基因整合到大肠埃希菌DH5α的染色体上组氨酸操纵元位点构建包装菌株,经氯霉素抗性筛选并用PCR及组氨酸表型鉴定,获得包装菌株DH-gIII;将缺失功能基因III的缺陷型噬菌体基因组转化到包装菌株中培养制备辅助噬菌体,以集落形成试验来检测缺陷型噬菌体的感染能力,结果滴度可达到4.3×108,只具备一次感染力,表明包装菌株构建成功,能用来制备辅助噬菌体,有望用于SIP体系。
- 高荣凯王芃王琰
- 关键词：RED重组系统辅助噬菌体
- α-银环蛇毒素的基因克隆及融合表达
- 蛇神经毒素是毒蛇咬伤的一个重要致命因素,研制相应的特效治疗药物如抗体等非常必要.此外蛇毒素本身还有很好的药用价值,在临床上重症肌无力的诊断、顽固性神经痛和肌萎缩性侧索硬化症的治疗以及戒毒等方面具有广阔的应用前景。天然来源...
- 高荣凯曲佳王欲晓乔媛媛赵晓航
- 文献传递
- 随机化CDR3抗体库的构建及不经免疫制备抗体的初步探索被引量：12
- 1997年
- 为探索利用噬菌体抗体库技术不经免疫制备抗体，在已有的抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓ）人Ｆａｂ段基因的基础上，通过ＰＣＲ引入突变，对其ＶＨＣＤＲ３中１２个氨基酸残基（９５～１００Ｊ）进行了完全随机化，对９４和１００Ｋ位残基进行了有限随机化，构建了半合成噬菌体抗体库，库容为２×１０８，５８％含有随机化ＣＤＲ３序列，用无关抗原小鼠ＩｇＧ对该抗体库进行筛选，获得了三个可与小鼠ＩｇＧ结合而不与ＨＢｓ反应的克隆，经测定其ＣＤＲ３的ＤＮＡ序列，发现这三个克隆具有相同的ＣＤＲ３，证明单纯改变ＶＨＣＤＲ３可以得到新的特异性抗体，从而绕过免疫制备抗体。
- 王琰化冰刘群英高荣凯朱迎春陈宇萍
- 关键词：噬菌体抗体
