袁振华
- 作品数：14 被引量：31H指数：3
- 供职机构：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划广东省科委重点攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 介导RNAi的tRNA^(Val)启动子质粒载体的建立被引量：1
- 2003年
- 目的 构建以tRNAVal启动子控制shRNA转录引发RNAi的质粒载体。方法 从人基因组中用PCR方法扩增出tRNAVal基因片段,人工突变去除3’末端数个碱基,连以Linker序列,用此经过改造的tRNAVal启动子,构建控制针对荧光素酶的shRNA转录载体pUC-tRNAVal lucRi,与pMAMneoLuc共转染BHK-21细胞,观察对荧光素酶表达的影响。结果pUC-tRNAVal lucRi可以高效特异性抑制pMAMneoLuc中荧光素酶的表达,效率达97.1％-99.5％。结论tRNAVal启动子载体可以高效转录shRNA,引发哺乳动物细胞RNAi现象。
- 鲁晓春袁振华彭建强马鑫吴小兵李小鹰
- 关键词：RNAI荧光素酶基因片段
- 重组腺病毒介导的肌浆网钙ATP酶在大鼠心肌细胞的过表达
- 2004年
- 目的:为研究和评估SERCA2a在充血性心力衰竭的基因治疗中的价值和SERCA2a转基因对心力衰竭病生理的影响。方法:采用重组腺病毒AdEasy系统,构建了含SERCA2a cDNA的重组病毒载体rAd-trSER-CA2a。感染培养的乳鼠心肌细胞,以RTPCR和Western Blotting检测SERCA2a在心肌细胞中的表达。结果:经PCR法和Southern确定目的基因SERCA2a存在于rAd-trSERCA2a基因组中,且连续传代保持其遗传稳定性。感染组心肌细胞SERCA2a蛋白mRNA和蛋白含量分别为对照的4.6倍和1.5倍。结论:我们成功地构建了含SER-CA2a的重组腺病毒rAd-trSERCA2a,该病毒可有效介导SERCA2a在心肌细胞中的表达。
- 鲁晓春李小鹰袁振华李世英马鑫吴小兵
- 关键词：重组腺病毒介导肌浆网钙ATP酶心肌细胞充血性心力衰竭
- 用SARS冠状病毒全基因组芯片杂交方法分析SARS-CoV被引量：7
- 2003年
- 为从临床样品中检测和分析SARS CoV病毒打基础 ,并为分析SARS CoV病毒的复制和转录等机理提供一种有效方法。以SARS冠状病毒TOR2株序列作为标准设计和制备一种覆盖SARS冠状病毒全基因组的寡聚核苷酸芯片 ,探针长度为 70nt,每相邻的探针序列重复 2 5nt,共660条。用该芯片分析了细胞培养的SARS CoV病毒总RNA、7个SARS CoV病毒的基因克隆片段。对RNA样品用随机引物进行反转录PCR获得cDNA。对DNA用随机引物扩增和dUTP cy3标记。结果用这种芯片杂交检测SARS CoV病毒RNA可见阳性信号呈全基因组分布 ,并且有多处连续的阳性信号点 ;用正常人的白细胞RNA为对照 ,杂交未出现明显阳性信号。检测 7个SARS CoV病毒基因克隆片段 ,在该片段相应的探针区段出现连续阳性信号点。这种方法可有效地检测和分析样品中SARS冠状病毒全基因组的信息。
- 吴小兵任鲁风马鑫何新洲袁振华刘凤杰赵革新杨宇张猛董小岩侯云德
- 关键词：SARS冠状病毒全基因组SARS-COV基因芯片
- 重组35型腺病毒介导人骨形成蛋白基因对脂肪源性干细胞的诱导分化被引量：3
- 2007年
- 目的在体外运用人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein7,hBMP-7)基因重组35型腺病毒(recombinant adenovirus's containing fibers derived from B-group serotype35,rAd5/F35)诱导大鼠脂肪源性干细胞(adipose-derived adult stem cell,ADASC)向成骨细胞定向分化,为骨组织工程探索新的细胞来源。方法以pcDNA1.1/氨苄青霉素-hBMP-7质粒为模板扩增hBMP-7基因,将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP-7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP-7共转染293细胞,同源重组产生rAd5/F35-hBMP-7。同样的方法构建rAd5/F35-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)。在体外分别转染大鼠ADASC并留置空白对照。观察细胞形态和生长情况,ELISA检测转染基因的转录和表达,检测钙结节和骨钙素等成骨细胞表型。结果PCR、酶切鉴定表明rAd5/F35-hBMP-7质粒构建正确。rAd5/F35-EGFP对大鼠ADASC中转染效率可达90%以上,hBMP-7基因存在于转染后的ADASC中并表达相应的蛋白,诱导组钙结节形成,电镜见胞质中有钙质成分,碱性磷酸酶阳性,骨钙素表达增强。结论rAd5/F35介导hBMP-7基因可促进ADASC向成骨细胞定向分化。
- 康焱廖威明袁振华张珑涓原向伟雷磊黄保丁
- 关键词：腺病毒脂肪源性干细胞人骨形成蛋白基因治疗
- 一种携带人α1bIFN的单纯疱疹病毒载体的构建被引量：2
- 2003年
- 为研究用单纯疱疹病毒作为表达细胞因子载体的生物重要性,构建了一种表达人α1b干扰素(IFN)的新型单纯疱疹病毒载体。基于一组含有完整单纯疱疹病毒全基因组的粘粒,α1bIFN表达盒插入到cosmid6上HSV1的UL2基因中,生成cos6-αIFN△UL2。通过将cos6-αIFN/△UL2与cosmid28、cosmid14、cosmid56和cosmid48共转染BHK-21细胞,同源重组产生重组病毒HSV1-αIFN/△UL2。在体外用标准VSV空斑抑制试验检测重组毒感染细胞上清α1bIFN的表达。证实HSV1-αIFN/△UL2感染的细胞中表达的人α1bIFN是有生物活性的。MOI=10感染时,24h后产生2 8×104IU/ml。而对照病毒感染时,这些细胞并不分泌可以检测到的α1bIFN。鉴于HSV1载体的嗜神经性,该载体对于分析体内神经系统局部表达的IFN的抗病毒能力是有用的。
- 马鑫袁振华张辉王宏吴小兵
- 关键词：干扰素细胞因子
- 抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究
- 2009年
- 以纯化的重组AAV2病毒颗粒为抗原免疫小鼠,获得7株稳定分泌抗AAV2衣壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其中B10和G4两株单克隆抗体具有中和活性,抗体亚型分别为IgG1和IgG2a型。对这两株单克隆抗体与rAAV病毒结合的特性进行了研究。单克隆抗体B10和G4对rAAV2病毒颗粒的结合均具有良好的血清型特异性,并且这种特异结合作用不被肝素阻断。这两株抗体都不阻断AAV2病毒与敏感细胞的结合,提示它们与病毒颗粒的结合位点都不处于AAV2病毒与主要受体结合的部位内。Western blotting检测结果显示,B10与AAV2的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3均能结合,而G4不能与AAV2的这三种衣壳蛋白结合。这说明B10与AAV2结合的位点位于衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠部分处并且可能是线性表位,而G4则可能是针对AAV2病毒颗粒构象表位的抗体。这两种结合特性不同的单克隆抗体为研究AAV2病毒颗粒的表面特性和感染特性提供有用的工具。
- 谭淑萍袁振华田文洪董小岩吴小兵
- 关键词：单克隆抗体中和抗体
- 一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建
- 2006年
- 为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2rep基因和AAV5cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插入cos6粘粒上HSV1基因组片段的UL2基因中,而将EGFP的表达单位插入cos56粘粒上HSV1基因组片段的UL44基因中,用这2个重组粘粒与其它3个粘粒(cos14、cos28、cos48)共转染BHK-21细胞获得了重组病毒HSV1-r2c5-EGFP并进行了空斑纯化。HSV1-r2c5-EGFP病毒能够在BHK-21细胞连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光。用PCR方法以及Southern杂交方法表明所获得的HSV1-r2c5-EGFP中携带有rep2cap5基因,用HSV1-r2c5-EGFP感染携带报告基因LacZ的AAV载体细胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/5-LacZ。结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c5-EGFP可提供AAV2/5载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒。
- 连忠辉袁振华吴小兵
- 关键词：单纯疱疹病毒腺相关病毒辅助病毒
- 靶向性AAV2载体的研究
- 重组腺病毒相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus，rAAV)具有无致病性、免疫原性低、安全性好、能感染种类众多的组织细胞、可介导外源基因长期表达等特点，是一种比较理想的基因治疗...
- 袁振华
- 关键词：基因治疗腺病毒相关病毒病毒载体
- 文献传递
- 腺病毒载体介导的RNAi对SK-BR-3细胞c-Met表达的影响
- 2006年
- 目的:通过腺病毒载体介导的RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞HGF受体c-Met的表达,抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。方法:PCR法获得人U6启动子及带有c-Met反向互补靶序列的片段HU6shmet;利用腺病毒载体将其传递至SK-BR-3细胞;RNA狭缝杂交检测SK-BR-3细胞c-Met mRNA水平,Western印迹检测c-Met蛋白水平。结果:获得了带有人U6启动子及c-Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2。转导了重组腺病毒的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA和蛋白相对表达量均有所下降。结论:腺病毒载体rAdUshmet通过抑制HGF受体c-Met表达,能在一定程度上阻断HGF-c-Met信号转导通路,有可能成为对乳腺癌进行基因治疗的有效载体。
- 赵慧陈东袁振华王忠山吴小兵
- 关键词：肝细胞生长因子腺病毒
- AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达被引量：10
- 2002年
- 目的 构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法 从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒pSNAV U6 Luc。与pMAMneoLuc质粒共转染BHK 2 1细胞 ,检测其对荧光素酶表达的影响。并且单独转染荧光素酶细胞株 ,检测其抑制荧光素酶表达的效果。结果 pSNAV U6 Luc对共转染的pMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制 5 0 % ,而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制 70 %。结论 实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK 2 1细胞中的表达。
- 马鑫鲁晓春彭建强谭淑萍袁振华尹芳王宏吴小兵侯云德
- 关键词：质粒介导荧光素酶短发夹环RNA哺乳动物
