李文婧
- 作品数：2 被引量：4H指数：2
- 供职机构：上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 大西洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus L.)hipposin抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其纯化被引量：2
- 2016年
- Hipposin是大西洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus L.)组蛋白H2A的N端衍生物,共含51个氨基酸残基,具有抑制革兰氏阳性和阴性菌的活性。根据毕赤酵母密码子偏爱性对编码hipposin的cDNA(hip)进行密码子优化,并在5'端添加信号肽酶kex 2识别位点的编码序列、3'端添加6×His标签编码序列,两个末端分别添加Xho I和Xba I酶切位点,与表达载体pPICZαA构建重组表达载体pPICZαA-hip;电转至毕赤酵母X-33中,经Zeocin筛选以及对酵母基因组DNA的PCR鉴定,获得高拷贝酵母转化子;将其在30℃,250 r/min培养,使用1%的甲醇诱导表达目的蛋白;采用固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化目的蛋白。培养96 h时目的蛋白的表达量最高;Western Blot分析显示,表达产物能与His单克隆抗体发生特异性反应;培养上清经纯化后获得高纯度的重组体HIP,但发现部分产物被蛋白酶降解。研究结果为hipposin抗菌肽的扩大制备奠定了基础。
- 李文婧陶妍
- 关键词：毕赤酵母
- 基于SOE-PCR的两种鱼类hepcidin基因串联及其在毕赤酵母中的表达被引量：3
- 2015年
- Hepcidin抗菌肽是由生物肝脏细胞表达的一类具有抗菌作用和铁代谢调节功能的碱性小分子肽,它们在机体免疫系统中发挥了重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。通过重组DNA表达技术制备抗菌肽无疑是一条良好的途径。为扩大hepcidin的抗菌谱和提高其表达量,通过SOE-PCR将斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus hepcidin成熟肽的c DNA"m CH"与尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus hepcidin成熟肽的c DNA"m TH"进行串联,并在两端分别添加Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,以p PIC9K为真核表达载体,成功构建了"p PIC9K-m CH-m TH"重组表达载体;电转化进毕赤酵母GS115中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选以及对酵母基因组DNA的PCR鉴定,得到高拷贝酵母转化子;在30℃、以1%的甲醇诱导表达不同时间后,经Tricine-SDS-PAGE分析,表明发酵培养72 h时目的蛋白的表达量最高,达77 mg/L。发酵上清经SP-Sepharose阳离子交换层析纯化后获得高纯度的目的蛋白。抑菌实验显示含目的蛋白的发酵上清和经纯化后的重组目的蛋白对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有良好的抑菌效果。本研究结果为hepcidin抗菌肽的产业化生产奠定了良好的基础。
- 李文婧陶妍赵冬梅徐冰冰
- 关键词：抗菌肽毕赤酵母SOE-PCR
