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Calmodulin及其突变体与去磷酸化的Cav1.2钙通道片段CT1的结合情况: 目的研究Calmodulin(CaM)及其突变体与去磷酸化CT1的结合情况。方法本实验中研究的CaM突变体包含CAM12(N-lobe上的两个Ca结合发生突变)、CAM34(C-lobe上的两个Ca结合发生突变)和CAM...; 王红梅何桂林邵冬雪封瑞孙威郝丽英; 文献传递

Na_v1.2IQ及其癫痫突变体的表达纯化和活性鉴定被引量：1: 2016年; 目的构建电压门控性钠通道亚型Na_v1.2IQ片段及其癫痫突变体的质粒,制备高浓度和高纯度的体外重组蛋白并进行活性鉴定。方法将Na_v1.2 IQ片段及癫痫突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导Na_v1.2 IQ片段及癫痫突变体GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化。应用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量;采用Bradford方法测定GST蛋白浓度;应用pull-down法检测纯化后蛋白的活性。结果 Na_v1.2IQ片段及其癫痫突变体在体外大肠杆菌中具有较高的纯度和表达量,与钙调蛋白在体外能够直接结合,证明制备的蛋白片段具有一定活性。结论成功分离纯化了稳定高效的体外重组Na_v1.2IQ及其癫痫突变体蛋白,为研究Na_v1.2与相关调节因子在癫痫发病的作用提供理论依据。; 郑敏王千慧封瑞李智马中女孙威毛楠高青华郝丽英郭凤; 关键词：钙调蛋白突变体癫痫

无镁诱导培养大鼠海马神经元与SH-SY5Y细胞自发性放电的变化被引量：4: 2012年; 目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元和SH-SY5Y细胞建立癫痫放电模型。方法采用新生24 h内Wistar大鼠,分离海马神经元进行原代培养。无镁细胞外液处理体外培养至10 d的神经元和传代培养的SH-SY5Y细胞3 h后恢复正常细胞外液,应用全细胞膜片钳技术记录2种细胞的放电情况。结果无镁处理后的神经元存在自发性的"癫痫样"放电;SH-SY5Y细胞未出现"癫痫样"放电。结论细胞间通过突触联系形成网状结构可能是诱导"癫痫样"放电的必要条件之一。; 郭凤姚阳孙威孙雪菲宫建郝丽英; 关键词：海马膜片钳癫痫

变性再复性方法提取高纯度Cav1.2片段GST-CT1及其生物活性的鉴定被引量：3: 2014年; 目的探寻诱导谷胱甘肽转移酶(GST)与Cav1.2钙通道片段CT1重组的易形成包涵体的大分子融合蛋白的提取与纯化的方法。方法在E.coli BL21中转化入p GEX-6p-3/CT1重组质粒并诱导表达,采用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER分离纯化GST-CT1融合蛋白,用Pull down assay方法鉴定GST-CT1融合蛋白及其生物活性。结果应用GST包涵体变性复性试剂盒和非离子去污剂B-PER能够分离得到高纯度的易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白,且分离纯化的GST-CT1融合蛋白具有与钙调蛋白结合的生物活性。结论操作简易的GST包涵体变性复性法能够针对易形成包涵体的GST-CT1融合蛋白进行分离和纯化,且得到的蛋白具有生物学活性。; 孙宇封瑞孙威胡慧媛郝丽英; 关键词：包涵体钙离子通道

高通量筛选酸敏感离子通道1a抑制剂研究: 2016年; 目的建立体外稳定过表达酸敏感离子通道1a(ASIC1a)的Fisher大鼠甲状腺上皮细胞(FRT细胞),采用Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM和细胞毒性检测〔乳酸脱氢酶(LDH)释放法〕测定ASIC1a活性,探讨高通量筛选ASIC1a抑制剂的可行性。方法2014年1月—2016年2月,利用分子生物学方法,构建ASIC1a过表达载体pc DNA3.1/myc-His-m ASIC1a,通过细胞转染技术建立了稳定过表达ASIC1a的Fisher大鼠FRT细胞。将细胞分成两组,对照组(FRT细胞)和实验组(稳定过表达ASIC1a的FRT细胞),并分别未负载和负载Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM,采用酶标检测仪测定双波长(340 nm和380 nm)的值,计算F340/F380。对照组和实验组细胞经不同p H值酸液(p H值7.5、7.0、6.5、6.0、5.5)刺激后,采用酶标检测仪测定450 nm波长处LDH释放量。结果对照组与实验组未负载Fura-2/AM细胞F340/F380比较,差异无统计学意义(P>0.05);实验组负载Fura-2/AM细胞F340/F380较对照组升高(P<0.05);对照组和实验组负载Fura-2/AM细胞F340/F380较未负载Fura-2/AM细胞升高(P<0.05)。p H值6.5、6.0、5.5时,实验组细胞LDH释放量大于对照组(P<0.05);对照组和实验组细胞不同p H值时LDH释放量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究成功建立稳定过表达ASIC1a的FRT细胞,Ca^(2+)敏感荧光染料Fura-2/AM和细胞毒性检测(LDH释放法)两种方法测定ASIC1a活性,使高通量筛选ASIC1a抑制剂成为可能,为发现高选择性和高活性的天然小分子ASIC1a抑制剂奠定了基础。; 羿菲李小曼白宁孙威姜波张莹宋晓宇; 关键词：上皮细胞乳酸脱氢酶

遗传性癫痫大鼠海马ERK与p38蛋白的异常变化被引量：3: 2014年; 目的研究遗传性癫痫大鼠(Tremor,TRM)海马中p-ERK、ERK、p-p38和p38蛋白的表达。方法以正常Wistar大鼠为对照组,PCR技术鉴定基因突变癫痫模型鼠TRM。提取大鼠海马组织后,应用免疫印迹法,检测大鼠海马中p-ERK、ERK、p-p38和p38的蛋白表达。结果与正常Wistar大鼠相比,TRM鼠海马中pERK与p-ERK/ERK蛋白表达量升高,而ERK蛋白表达量不变;TRM鼠海马中p-p38与p-p38/p38蛋白表达量高于正常Wistar大鼠,而p38蛋白表达量不变。结论 TRM鼠海马中p-ERK与p-p38表达上调,可能与TRM癫痫发病机制相关。; 赵金生徐晓雪孙晓宇王千慧高青华封瑞胡慧媛孙威马中女蔡际群郝丽英郭凤; 关键词：海马癫痫 ERK P38

无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中延迟整流钾电流的变化被引量：4: 2011年; 目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测延迟整流钾电流的变化。方法采用新生24 h内Wistar大鼠,分离海马神经元进行原代培养。体外培养至12~16 d时,无镁细胞外液处理神经元3 h并恢复正常细胞外液,应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况及延迟整流钾电流。结果无镁处理后的神经元存在自发的"癫痫样"放电;无镁诱导可使神经元延迟整流钾电流增大。结论延迟整流钾电流增大可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关。; 郭凤孙威姚阳高青华闵冬雨封瑞胡慧媛蔡际群郝丽英; 关键词：海马膜片钳癫痫放电延迟整流钾电流

水通道蛋白AQP5对小鼠骨髓间充质干细胞分化能力的影响被引量：3: 2016年; 目的探寻水通道蛋白5(Aquaporin 5,AQP5)对小鼠骨髓间充质干细胞分化能力的影响。方法采用RT-PCR和Western Blot方法检测AQP5在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达。定向诱导BMSCs后分别进行油红O染色(成脂),茜素红S和碱性磷酸酶染色(成骨),Collagen II和番红素O染色(成软骨)。检测钙离子、碱性磷酸酶和胞外糖胺多糖含量,Real-time PCR检测成脂、成骨和成软骨分化后的特异标记分子的相对+/+m RNA表达。结果 RT-PCR和Western Blot结果发现野生型(AQP5)BMSCs中有AQP5阳性条带。油红O、茜素红S、碱-/-性磷酸酶,Collagen II和番红素O染色阳性染色率在AQP5敲除型(AQP5)BMSCs明显高于野生型。Real-time PCR结果证-/-实AQP5 BMSCs在成脂、成骨和成软骨分化特异标记分子的相对m RNA表达水平显著提高。结论小鼠BMSCs中有AQP5表达,AQP5敲除显著提高BMSCs的成脂、成骨和成软骨分化能力。; 羿菲张莹李小曼白宁刘汀孙威曹流; 关键词：AQP5 分化潜能小鼠

PreIQ及其突变体载体构建表达纯化和活性鉴定被引量：2: 2014年; 目的构建心肌L型钙通道片段PreIQ及其突变体与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化和活性鉴定。方法将PreIQ及其突变体的cDNA插入pGEX-6p-1质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养并利用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导PreIQ及其突变体的GST融合蛋白表达,GS-4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE鉴定目的蛋白分子质量和相对纯度。采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度。采用pull-down法检测纯化后蛋白的活性。结果 PreIQ及其突变体融合蛋白得到了大量表达;纯化的PreIQ及其突变体具有较高的纯度;纯化后蛋白能与钙调蛋白(CaM)结合,具有生物活性。结论本研究成功构建了PreIQ及其突变体融合蛋白原核表达载体,获得具有生物活性的PreIQ及其突变体融合蛋白,为深入研究PreIQ的生能学功能奠定基础。; 孙威封瑞郭凤赵金生赵美眯高青华王红梅毛楠郝丽英; 关键词：融合蛋白突变体

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孙威

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