杨振兴
- 作品数：53 被引量：115H指数：8
- 供职机构：云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室更多>>
- 发文基金：公益性行业(农业)科研专项国家自然科学基金国家公益性行业科研专项更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：1
- 2021年
- 本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。
- 李占鸿宋子昂杨振兴肖雷李卓然谢佳芮李华春杨恒
- 关键词：VP7蛋白原核表达多克隆抗体
- 云南省墨江县库蠓中一株西藏环状病毒的分离及全基因组序列分析被引量：1
- 2022年
- 西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)于2009年首次从中国西藏自治区采集的圆斑按蚊中分离出,目前在中国的云南省、广东省、湖南省和临国日本均有分离报道。2017年我们从云南省墨江县采集的库蠓样品中分离到一株病毒(MJC1-7),接种BHK-21和C6/36细胞后均可产生聚集、皱缩和脱落等明显细胞病变。1%的琼脂糖凝胶电泳显示,病毒基因组为十节段的双链RNA,呈现“3-3-3-1”的带型。通过病毒全长cDNA扩增和测序获取MJC1-7毒株的全基因组核苷酸序列,病毒基因组全长为19260 bp(包括编码区18495 bp和非编码区735 bp),由Seg-1(3950 bp)至Seg-10(832 bp)的10个基因节段构成,可编码6165个氨基酸残基。对环状病毒保守的VP1(Pol)、VP3(T2)和VP7(T13)蛋白氨基酸序列及系统发育分析显示,MJC1-7毒株与TIBOV亲缘关系最近,氨基酸序列相似度为95.4%~99.7%。对决定环状病毒血清型VP2(OC1)蛋白氨基酸序列与系统发育分析显示,MJC1-7与云南(SX-2017a、DH13C120和YN15-283-01)和广东(D181/2008)分离的TIBOV毒株聚为一簇,氨基酸序列相似度为97.3%~98.6%,而中国西藏毒株(XZ0906)和日本毒株(KSB-8/C/09和KSB-3/C/10)形成了另外3个独立的进化分支,MJC1-7与其相似度仅为27.8%~41.8%,以上结果表明MJC1-7毒株与云南和广东毒株有更近的亲缘关系,而中国西藏和日本毒株可能为Seg-2(OC1)基因变异较大毒株。本研究报道了一株TIBOV在我国云南省墨江县库蠓上的分离以及全基因组序列分析,研究结果进一步丰富了我们对TIBOV的认知,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性与病原学检测技术提供了基础数据。
- 杨振兴孟锦昕何于雯李楠王静林
- 关键词：库蠓病毒分离
- 云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析被引量：2
- 2021年
- 2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(BTV-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BTV-7型毒株并掌握其遗传特征。作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、BHK-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细胞上的感染特性,采用高通量测序获取分离毒株的全基因组序列,通过qRT-PCR与血清中和试验对哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体变化进行回溯分析。结果表明:2020年5月,分离到1株能引起BHK-21细胞发生细胞病变的病毒(毒株号V303/YNJH/2020),经鉴定为BTV-7型。分离毒株的基因组全长19154 bp(GenBank收录号MW046280至MW046289),与广东省2014年分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,基因节段1至6,基因节段9与10的核酸与编码蛋白氨基酸序列(nt/aa)相似度分别大于98%、99%;V303/YNJH/2020毒株的基因的节段7和基因节段8属Western地域型,与广东GDST008毒株对应基因节段的nt/aa序列相似度仅为71.5%/81.6%、79.6/%84.4%。病毒蚀斑与增殖曲线比较显示,V303/YNJH/2020在BHK-21细胞的增殖能力明显强于GDST008。回溯分析显示,感染V303/YNJH/2020的哨兵牛未出现临床症状,血液中的病毒核酸持续存在长达12周;在病毒感染后第4~9周,血液中的中和抗体滴度水平维持在1∶256。云南省2020年分离的BTV-7型V303/YNJH/2020毒株与广东省分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,在BHK-21细胞上的增殖能力强于GDST008毒株;V303/YNJH/2020虽未引起感染动物的临床症状,但病毒核酸与中和抗体在感染动物血液中长时间存在。研究结果为开展BTV-7型在我国的演化规律、病毒变异以及致病性等方面的研究奠定了基础。
- 李占鸿宋子昂廖德芳杨振兴谢佳芮高翔胡忠燕李卓然李华春杨恒
- 关键词：蓝舌病病毒全基因组测序基因重配
- 广西鹿流行性出血热病毒血清型调查及分布影响分析被引量：9
- 2016年
- 2014年采集广西5市7县7个养殖场313份牛血清,经cELISA检测随机筛选出100份鹿流行性出血热病毒(EHDV)血清强阳性样品(cut-off值>70%)进行微量细胞中和试验,以调查广西EHDV血清型的存在情况,以及分析其地理分布的影响因素,为丰富EHDV流行病学数据,进一步做好EHDV的综合防制提供依据。
- 张怡轩林俊曹颖颖朱建波杜毅超杨振兴姚俊李华春吴健敏
- 关键词：CELISA
- 版纳病毒和芒市病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立及应用
- 2022年
- 为建立版纳病毒(BAV)和芒市病毒(MSV)的可视化RT-LAMP检测方法,根据我国分离的BAV(YNSZ043)和MSV(V301/YNJH/2019)毒株Seg-12基因的保守序列,分别设计2对特异性引物和1条环引物,通过反应条件优化,分别建立了2种病毒的可视化RT-LAMP检测方法,其最佳反应条件为64℃50 min,分别利用2种方法检测西藏环状病毒、流行性出血病病毒、蓝舌病病毒、中山病病毒、广西环状病毒和阿卡斑病毒等虫媒病毒的核酸样品,结果2种方法仅能分别检测出BAV和MSV,其他虫媒病毒均无非特异性扩增。灵敏度试验检出BAV和MSV的最低检测限制分别为13.7拷贝/μL和19.0拷贝/μL,敏感性是常规RT-PCR的10倍以上。应用2种病毒的RT-LAMP及RT-PCR方法分别对2596只蠓虫和蚊虫的核酸样品进行检测,结果阳性检出率均是RT-PCR的2倍以上。结果表明,建立的BAV和MSV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高和可视化等优点,为我国开展2种病毒的现场快速检测与流行病学研究提供了有效的技术支撑。
- 杨振兴李卓然何于雯李占鸿李乐廖德芳杨恒朱建波
- 关键词：版纳病毒
- 流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定被引量：17
- 2019年
- 流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。
- 杨振兴孟锦昕肖雷朱建波廖德芳高林李占鸿杨恒李华春
- 关键词：病毒分离鉴定血清型
- 云南省蓝舌病病毒“历史毒株”的遗传特征被引量：2
- 2020年
- 20世纪90年代,本实验室从云南省哨兵动物采集的血液中分离到7种血清型蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)。但这些毒株的遗传特征至今仍不清楚,因而阻碍了我国的BTV演化历史分析。为掌握云南省早期流行BTV毒株的遗传特征,对1995—1997年云南省分离的25株BTV毒株的基因组节段2、3、7和10(Seg-2、-3、-7、-10)进行一步法RT-PCR扩增、测序以及序列分析。Seg-2序列分析显示,1995—1997年云南省分离到的7种不同血清型(BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16)BTV毒株,分属A、B、G、H、I和J等6种基因型;BTV-12型毒株的Seg-2为西方地域型,其余毒株的Seg-2则属于东方地域型;Seg-3和Seg-10序列分析显示,25株BTV毒株均为东方地域型;Seg-7序列分析显示,1株BTV-2型、2株BTV-12型和1株BTV-16型毒株属于西方地域亚型,并与南非和荷兰BTV毒株的Seg-7具有最近的亲缘关系,其余毒株则均为东方地域型。上述结果表明,云南省存在多种血清型BTV的流行,而Seg-2和Seg-7基因重配毒株的发现,提示国外的西方地域型毒株已侵入云南省,并在传播过程中与我国毒株发生了基因重配。本研究为我国BTV的演化分析与溯源研究提供了数据参考。
- 李卓然朱建波廖德芳肖雷王金萍高林杨振兴李占鸿杨恒李华春
- 关键词：蓝舌病病毒基因重配血清型
- 流行性出血病病毒(EHDV)血清型特异性荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用被引量：3
- 2020年
- 流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,本研究旨在建立EHDV的血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)诊断技术。以决定EHDV血清型的基因节段2(Seg-2)作为靶基因,设计8对特异性扩增引物和TaqMan探针,以不同血清型EHDV代表毒株的cDNA为模板,分析检测方法特异性、敏感性;以不同血清型的EHDV分离毒株及临床血液样本为检测对象,分析该方法的实际检测效果。实验结果显示:建立的EHDV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有高度的特异性和灵敏性,可准确鉴定不同血清型EHDV,与蓝舌病病毒、中山病病毒和阿卡斑病毒之间均无交叉反应;qRT-PCR反应的扩增效率均达到90%以上,对不同血清型EHDV核酸检测灵敏度在24拷贝/μL^44拷贝/μL之间。对我国分离的31株EHDV进行血清型qRT-PCR鉴定,结果显示分离的EHDV分别为EHDV-1(6株)、EHDV-5(9株)、EHDV-6(11株)、EHDV-7(2株)与EHDV-10(3株)。对不同血清型EHDV感染动物的血液样本检测结果显示,本方法能在动物感染EHDV早期鉴定出病毒的血清型,与血液样本中分离EHDV毒株的血清型鉴定结果一致。本研究建立的EHDV血清型荧光定量RT-PCR定型方法具特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染EHDV血清型的快速与准确诊断,具有良好的应用与推广价值。
- 杨振兴李占鸿宋子昂朱建波李卓然李华春谢佳芮廖德芳杨恒
- 关键词：血清型荧光定量RT-PCR分子诊断
- 2019年云南省景洪市哨兵动物多种虫媒病毒的分离鉴定被引量：2
- 2020年
- 本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV),2株血清型分别为4型和5型的蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV),1株帕利亚血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)中的D’Aguilar virus(DAV)血清型病毒和2株未鉴定出的环状病毒。经病毒Seg-2、Seg-3序列ORF区的比对和进化分析显示,7株病毒的地域型均为Eastern型,与日本、澳大利亚和印度毒株具有最近的亲缘关系。3头哨兵动物的血液和血清,经病毒核酸及血清中和试验检测,证明3头动物均被相应的病毒感染。动物感染病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,3~4周后达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量2~4周到达最高点后则呈迅速下降趋势。本研究报道了景洪虫媒病毒的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性,研究结果为进一步了解当地的牛虫媒病毒提供数据支撑,同时3头牛分离获得7株病毒,提示当地可能还存在更多种类的虫媒病毒。
- 杨振兴寇美玲廖德芳高翔胡忠燕李占鸿谢佳芮李华春杨恒
- 关键词：病毒分离鉴定
- 我国牛羊蓝舌病血清学调查被引量：8
- 2020年
- 为了解蓝舌病(BT)在我国的流行和分布情况,本试验采用竞争酶联免疫吸附法(C-ELISA)对我国重庆、新疆、西藏、湖北、河北、广西、贵州、内蒙古、吉林、辽宁、四川、云南共12个省区的19237份血清进行检测。结果显示,被调查地区均存在蓝舌病病毒(BTV)的流行,平均阳性率为4.33%~38.14%,且血清阳性率具有明显的地域性和季节性,低纬度地区的血清阳性率普遍高于高纬度地区(4.33%~38.14%),以第3季度(7~9月)阳性率最高(23.3%~46.7%),第1季度(1~3月)阳性率最低(0~13.3%),说明BTV的流行与虫媒的活动密切相关。本试验开展的BTV血清学调查,明确了蓝舌病在被调查地区的流行情况,也为蓝舌病的监测和预防提供了可靠参考。
- 朱沛肖雷苗海生杨振兴谢佳芮朱建波李华春
- 关键词：蓝舌病竞争ELISA
