姜海滨
- 作品数：7 被引量：3H指数：1
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 猪naive-like多能干细胞系的建立
- 多能干细胞是一类具有无限制自我更新能力、同时可以分化成特定组织细胞的细胞,其主要包括胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell,ESC）与诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cel...
- 姜海滨
- 关键词：诱导性多能干细胞红色荧光蛋白胚胎干细胞
- 整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立
- 2017年
- 目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的相关研究奠定基础。方法:以PEF细胞c DNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),最终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体p TRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的p EF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系。结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1(975bp)、LIN28(727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,最终构建了3个表达载体(p TRE3G-Zs-OCT4、p TRE3G-Zs-TBX3、p TRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与p EF1a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高。结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系。
- 张曼玲陈袁赵丽华李艳如金永王俊政姜海滨陈俏羽李荣凤
- 关键词：IPS细胞
- 建立稳定表达猪LIF蛋白的小鼠STO细胞系被引量：1
- 2016年
- 目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(i PS细胞)。方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体p CAG-p LIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-p LIF细胞)。通过RT-PCR、q PCR、Western blot等方法检测STO-p LIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-p LIF细胞作为饲养层,培养大鼠i PS细胞。通过生长曲线检测、碱性磷酸酶染色、干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-p LIF细胞饲养层在大鼠i PS细胞培养方面的功能。结果:STO-p LIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠i PS细胞在形态、多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠i PS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠i PS存在差异(P<0.05)。结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-p LIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠i PS细胞培养中具有一定优势。
- 陈袁赵丽华杨宁张曼玲金永侯道荣吴兆强李艳如姜海滨李荣凤
- 关键词：饲养层细胞
- 猪naive-like诱导性多能干细胞系的建立及红色荧光蛋白标记被引量：1
- 2017年
- 目的 :建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,i PS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive i PS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法:首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体Tet O-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rt TA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)进行诱导,建立起猪i PS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定。在此基础上,向i PS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性。结果:所建立的i PS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like i PS细胞系。成功对所建立的i PS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的i PS细胞的多能性依然存在。结论:成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like i PS细胞系。
- 姜海滨张曼玲赵丽华金永陈袁王俊政陈俏羽李荣凤
- 关键词：多能性红色荧光蛋白
- 猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞体外诱导分化
- 2019年
- 目的:将猪naive-like胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞,为猪多能干细胞诱导神经分化方法的建立提供参考。方法:利用小分子化合物β-巯基乙醇、B-27、肝素等组成的神经诱导培养液,采用直接分化法,分化得到神经样细胞,对其进行神经特异性基因表达鉴定,同时检测分化后的细胞是否已经丧失多能性。结果:分化所得到的神经细胞具有明显的神经细胞结构特征,RT-PCR和免疫荧光结果显示分化后的神经细胞表达多种神经细胞特异性基因,qPCR结果显示分化后多能因子的表达显著降低,神经特异性基因表达显著升高,免疫荧光结果经统计分析后显示,低分子量神经微丝蛋白(light neurofilament protein,NF-L)阳性细胞率可达79%。结论:成功实现了体外直接诱导猪naive-like胚胎干细胞向神经细胞分化,为神经系统疾病修复与治疗研究奠定了基础。
- 王晨宇张曼玲姜海滨金永赵丽华刘曼菱陈俏羽王俊政尤志欢张红李荣凤
- 关键词：神经细胞诱导分化
- 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法
- 本发明提供了一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法，属于细胞生物学技术领域。本发明将iPSCs技术与传统胚胎干细胞技术相结合首先建立同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc‑MYC的转基因阳性猪胎儿成纤维细胞系；...
- 李荣凤张曼玲姜海滨杨宁
- 文献传递
- miRNA-205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用被引量：1
- 2018年
- 目的:构建miRNA-205过表达载体并研究miRNA-205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法:对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA-205前体序列,并将其克隆于基础表达载体p CAGDNA3-h Fat1,构建过表达载体p CAG-miR205。使用脂质体转染技术将该载体转染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞(含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)。利用干细胞培养液诱导培养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA-205的表达情况,比较分析miRNA-205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果:成功构建了p CAG-miR205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体细胞的miRNA-205表达量显著升高(P<0.01);利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。结论:研究结果表明在细胞水平上过表达micro RNA-205,可提高猪诱导性多能干细胞建系效率;已构建的miRNA-205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA-205的细胞系,为进一步深入研究miRNA-205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制打下基础。
- 陈俏羽赵丽华陈袁张曼玲侯道荣姜海滨王俊政刘曼菱王晨宇尤志欢李荣凤
- 关键词：诱导多能干细胞
