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小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因的克隆与表达: 2002年; 目的 :克隆小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因 ,并进行原核表达及蛋白纯化 ,为制备mNotch1的单克隆抗体做准备。方法 :计算机分析小鼠Notch1全长 ,PCR扩增其胞外段高抗原区编码基因 ,克隆入载体T -vector进行序列测定 ,然后将测定正确的片段连入GST融合表达载体pGEX - 4T - 1,得到pG -NEF ,转化宿主菌DH5α ,经IPTG诱导 ,SDS -PAGE分析 ,以及新生条带表达形式分析以后 ,用GST亲和层析柱纯化。结果 :小鼠Notch1分子胞外段近膜处约 170个氨基酸区域抗原性较高 ,PCR扩增得到大小约 5 0 0bp的特异性片段 ,序列测定结果与文献报导的完全一致 ;原核表达产物大小约Mr 43× 10 3 ,以包涵体形式存在 ,约占总蛋白的2 5 % ,纯化后目的蛋白含量 >95 %。结论 :成功地进行了小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因的基因克隆、原核表达及蛋白纯化。; 黄红艳柳天平孙强张蓉陈萍周鹏王冀姝李荣韩骅; 关键词：NOTCH1 基因克隆原核表达蛋白纯化

信号肽捕获系统的建立被引量：9: 2001年; 细胞分泌性蛋白的分泌有赖于蛋白质Ｎ端的信号肽的存在。利用酵母建立了从ｃＤＮＡ文库中筛选编码信号肽的基因片段的遗传系统。为此，用一步基因破坏法对酿酒酵母ＥＧＹ４８基因组中的ｓｕｃ２基因（编码酵母蔗糖转换酶）进行了定位突变，获得了无蔗糖转换酶表达的酵母株ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ。将无信号肽的ｓｕｃ２成熟肽基因克隆于酵母乙醇脱氢酶（ＡＤＨ１）基因启动子下游，得到用于文库筛选的酵母真核表达载体。启动子与成熟肽基因之间为多克隆位点，用于插入待筛选的ｃＤＮＡ文库。用此载体转化酵母ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ，所得克隆可在以葡萄糖为碳源的培养基上生长，但不能在以棉子糖为碳源的培养基上生长；在ｓｕｃ２成熟肽基因前分别插入ｓｕｃ２信号肽基因片段或人ＩＬ－２受体α 链信号肽基因片段，然后转染ＥＧＹ４８－△ ｓｕｃ，所得克隆既能在以葡萄糖为碳源的培养基上生长，也能在以棉子糖为碳源的培养基上生长。表明构建的系统可用于筛选插入多克隆位点的ｃＤＮＡ片段是否具有编码信号肽的功能。; 孙强王冀姝李荣周鹏黄红艳韩骅; 关键词：同源重组信号肽基因克隆

用suc2信号肽捕获系统筛选小鼠胚胎cDNA文库基因被引量：2: 2004年; PCR扩增 1 1d小鼠胚胎cDNA文库插入片段 ,将 0 .5～ 2 0kb的扩增产物插入筛选载体的多克隆位点 ,转化suc2基因缺陷酵母宿主菌 .然后将约 1 0 5个酵母菌落接种于选择性平板上进行筛选 ,得到了 1 82个可在选择性培养基上生长的菌落 .PCR扩增显示 ,插入片段大小分布于 0 1～ 1 5kb之间 .对其中 1 4个阳性菌落的重组子进行序列测定 ,分别代表 6种不同的基因序列 ,与报告基因都有正确的读框内融合 .其中两种基因序列反复被筛到 ,分别命名为spt1、spt2 .spt1 [gi:2 772 876 6 ],可能以非编码RNA的身份参与蛋白质向细胞外分泌的过程 ,而spt2编码多个连续的赖氨酸。; 孙强黄红艳周鹏冯蕾秦红韩骅; 关键词：非编码RNA 蛋白质分泌

ncRNA候选基因spt1的克隆与初步分析被引量：6: 2004年; 在用suc2信号肽捕获系统对小鼠胚胎cDNA文库筛选的过程中 ,反复获得一个相同的强阳性克隆 ,命名为spt1。对该克隆的序列分析表明 :插入序列由 6 97bp组成 ,6个开放阅读框中共有 37个启始密码子 (ATG)和 80个终止密码子 (TGA、TAG、TAA) ;没有较大的有意义开放读框存在。经BLAST分析 ,结果显示该序列定位于小鼠第17号染色体长臂 ,没有发现同源基因。Northernblot和RT PCR分析表明 ,该序列仅表达于小鼠卵巢组织 ,全长约4 5～ 5 0kb。酵母转化和序列截短实验提示 ,该序列能够介导蔗糖转换酶向细胞外的分泌。因此 ,推测spt1很有可能是一个新的非编码RNA的一部分 ,参与蛋白质的分泌过程。; 孙强黄红艳韩骅; 关键词：非编码RNA 蛋白质分泌

LIM蛋白KyoT2与人类紧密连接蛋白2的相互作用被引量：1: 2002年; KyoT是一种LIM结构域蛋白 ,是以RBP J为诱饵蛋白通过酵母双杂交系统得到的新分子。KyoT2可以抑制RBP J介导的转录。以KyoT2为诱饵蛋白 ,通过酵母双杂交筛选得到了人类紧密连接蛋白 2 (ZO 2 )的一种新的剪接体ZO 2 i3。序列分析表明 ,新的剪接体有 19个外显子 ,与已发表序列比较 ,见ZO 2 i3分子的激酶后区发生了改变。为排除酵母双杂交实验的假阳性 ,实验首先在酵母中验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用并得到阳性结果。进而在大肠杆菌中原核表达纯化带有His标签的KyoT2蛋白 ,使用抗His标签的抗体 ,通过GSTpull downassay验证KyoT2与ZO 2 i3的体外直接相互作用 ,也获得阳性结果。并通过酵母实验初步确定了其作用位点 ,即KyoT2通过LIM2结构域与ZO 2 i3相互作用。本实验验证了KyoT2与ZO 2 i3的相互作用 ,并初步确定其相互作用位点 ,对探讨KyoT的功能具有重要意义。; 黄红艳李荣孙强王健周鹏韩骅张万会; 关键词：LIM蛋白相互作用

LIM蛋白KyoT在小鼠胚胎发育中的表达被引量：1: 2003年; IM结构域蛋白KyoT可与转录因子RBP J相互作用而修饰Notch信号途径 .以往发现KyoT在成年小鼠肺脏、肾脏和睾丸中有特异性表达 ,为进一步明确KyoT在小鼠胚胎阶段的表达 ,故分析了KyoT在小鼠不同胚胎阶段的表达水平变化和胚胎 17天时各组织的表达分布 .采用RNA印迹发现KyoT在小鼠胚胎的各阶段均表达 ,而且胚胎 17天时表达水平最高 .进一步RNA印迹和免疫组织化学检测发现 ,KyoTmRNA和蛋白质在胚胎17天小鼠的肺、肾以及肌肉中均有高水平的表达 .上述结果提示 ,KyoT在小鼠胚胎发育过程中有特异性表达 ,且在胚胎 17天时KyoT表达器官分布与成年小鼠相似 ,特异性定位于肺、肾和肌肉等脏器 .; 李荣程轶梦陈蕾胡静孙强黄红艳王键韩骅; 关键词：小鼠胚胎发育

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黄红艳