李永海
- 作品数：9 被引量：12H指数：2
- 供职机构：蚌埠医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金安徽省高校省级自然科学研究项目安徽省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 水流动力学注射方法建立肝内胆管癌动物模型被引量：1
- 2017年
- 目的 建立一种小鼠肝内胆管癌动物模型。方法 采用水流动力学注射方法将表达Notch1基因胞内区活性形式pT3-EF1a-Notch1分子的胞内结构域（NICD1）转座子和表达myr-蛋白激酶B（Akt）基因转座子质粒溶液通过小鼠尾静脉注射至肝脏。注射生理盐水作为对照。注射4周后处死，病理学检查肿瘤发生情况，免疫组织化学、免疫荧光检测细胞角蛋白19（CK19）及标签蛋白流感病毒血凝素蛋白表面抗原决定簇衍生的蛋白标签序列（HA）标记的Akt表达。结果 实验组小鼠均形成肿瘤，成癌率为100%（14/14）；病理学检测为胆管细胞性肝癌，免疫组织化学检测CK19，14例中有9例强阳性表达（64.3%），证实瘤细胞是胆管细胞性肝癌。同样，在瘤细胞中检测到HA强阳性表达率为42.9%（6/14）；免疫荧光双标记CK19和HA升高。
结论 水流动力学注射方法成功构建肝内胆管癌小鼠模型且诱癌时间短，方法简单，重复性好。
- 朱方全秦中强李红俊陈勇李永海谈燚
- 关键词：肝内胆管癌转座子
- 凋亡的肿瘤细胞来源的细胞外囊泡在癌中的作用
- 2018年
- 细胞外囊泡(EVs)是由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡;凋亡的肿瘤细胞产生的囊泡(Apo-EVs)(凋亡小体)包含了众多的生物活性分子和细胞器,介导了肿瘤细胞间的信号传导,参与了肿瘤的生长过程。本文就Apo-EVs在癌的生长及转移过程中的作用作一综述;同时亦介绍了Apo-EVs在临床上的应用,包括作为诊断和预后的指标以及作为药物的输送载体。
- 杨天华李永海李正红
- 关键词：细胞凋亡肿瘤
- 修饰的pfu酶与T7ssb蛋白在聚合酶链式反应中的应用
- 2018年
- 表达、纯化pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并优化PCR反应体系。分别将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,转化至原核细胞中,诱导表达出pfu、pfu-sso7d及T7ssb蛋白,并通过His-Nickle亲和层析纯化柱纯化蛋白。从A549细胞中提取人的基因组DNA,以该基因组DNA为模板,利用pfu酶扩增c-met基因;同时从A549中提取总RNA,经过逆转录反应后,以逆转录产物c DNA为模板,分别利用pfu酶和pfu-sso7d酶扩增PD-L1基因,对比两种酶的DNA扩增效率;从MC38细胞中提取鼠的基因组DNA,以此基因组DNA为模板,分别用pfu-sso7d和pfu-sso7d联合T7ssb蛋白扩增Trp53基因,对比两种PCR反应体系的扩增效率。我们成功的将pfu、pfu-sso7d及T7ssb基因构建于p ET28载体上,并成功的诱导表达并纯化了这三种蛋白;用pfu酶成功的扩增出c-met基因;对比pfu酶,pfu-sso7d表现出较高的DNA扩增效率;在扩增Trp53基因的PCR反应体系中,同单独使用pfu-sso7d酶相比,pfu-sso7d联合T7ssb蛋白在PCR反应体系中可以提高PCR产物的量,约1.7倍。本次研究表明,利用纯化的pfu-sso7d蛋白和T7ssb蛋白,我们构建了优化的PCR反应体系。
- 刘明珠秦中强杨天华陈勇李永海李正红
- 关键词：PFUDNA聚合酶蛋白纯化
- 双荧光标记的肺癌皮下移植裸鼠模型的建立被引量：2
- 2019年
- 目的 建立荧光素酶(Luc)和近红外荧光蛋白(iRFP)双标记的肺癌皮下移植裸鼠模型.方法 采用Gateway法构建表达Luc和iRFP的慢病毒载体,经酶切测序验证后,制备慢病毒,感染肺癌A549细胞.嘌呤霉素筛选阳性A549细胞(即mA549细胞)并进行扩增,荧光显微镜下观察Luc和iRFP的表达,免疫荧光检测细胞表面c-Met蛋白的表达.将A549和mA549细胞分别接种至裸鼠皮下,每组6只,采用活体成像技术观察瘤体生长和荧光表达情况,HE染色和免疫组化染色评估成瘤状况.结果 成功构建了稳定表达Luc和iRFP的mA549细胞系.荧光显微镜下观察到mA549细胞中iRFP与Luc成功表达.免疫荧光检测显示,A549细胞和mA549细胞均可表达c-Met蛋白.mA549细胞接种裸鼠后,模型生长周期适中,成瘤率为100%;mA549细胞移植瘤的生长趋势与A549细胞移植瘤无明显差异(P>0.05).HE染色显示,mA549与A549细胞移植瘤的细胞形态和组织结构相同.免疫组化染色显示,A549和mA549细胞移植瘤均表达c-Met蛋白.结论 成功构建了稳定的、可实时监测的iRFP-Luc-A549肺癌细胞裸鼠模型.
- 樊红莲刘明珠闵静婷李红俊杨小淮李永海李正红
- 关键词：肺肿瘤荧光素酶活体成像
- 建立稳定高效表达绿色荧光蛋白和小鼠白血病抑制因子的STO细胞系被引量：1
- 2019年
- 目的:建立表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和小鼠白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的细胞系,并尝试使用其作为饲养层培养小鼠胚胎干细胞(ESC)。方法:构建含有GFP、mLIF和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒粒子,并感染STO小鼠成纤维细胞系,筛选得到稳定表达GFP和mLIF基因的细胞系(STO-GFP-mLIF);通过Western blot和ELISA方法检测STO-GFP-mLIF细胞中LIF基因的表达水平;经不同浓度(5,10,15,20μg/ml)丝裂霉素C处理不同时间(1.5,2.5,3,3.5 h)制备饲养层,并观察细胞在饲养层上增殖情况。将小鼠胚胎干细胞在丝裂霉素C处理过的STO-GFP-mLIF上培养,观察细胞集落生长情况。结果:STO-GFP-mLIF细胞中LIF蛋白表达水平上调(P <0.01);丝裂霉素C抑制STO-GFP-mLIF细胞增殖的最佳浓度及作用时间为10μg/ml与3 h,且小鼠胚胎干细胞可在该饲养层上发育成典型的"鸟巢"状干细胞集落。结论:成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白和小鼠LIF基因,同时可维持小鼠胚胎干细胞未分化状态的STO-GFP-mLIF细胞系。
- 刘传苗李红俊杨天华杨小淮李正红李永海
- 关键词：白血病抑制因子绿色荧光蛋白小鼠ES细胞
- 整合PD-L1单链抗体的融合蛋白制备及其抗肿瘤活性的验证被引量：1
- 2019年
- 目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(sc Fv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(sc Fv)。根据单链抗体基因序列,合成sc Fv抗体基因序列。选用sc Fv-mFc融合蛋白的方式,并采用p Fuse真核表达载体来表达此sc Fv-mFc融合蛋白,研究其对肺腺癌细胞(A549)的亲和力和体内外抑制作用。方法:采用基因工程的方法构建重组质粒p Fuse-scFv,通过真核转染至293F(人胚肾细胞),使用无血清Pro 293a-CDM培养72 h,收集培养液中分泌的融合蛋白,运用免疫组化检测sc Fv-mFc融合蛋白与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析融合蛋白和肿瘤细胞的亲和力; ADCC(抗体介导的细胞毒实验)测定融合蛋白对肿瘤细胞体外杀伤作用;利用接种肺腺癌细胞的荷瘤小鼠对融合蛋白的体内抗肿瘤效应进行研究。结果:通过重组质粒转染至293F细胞的方法,sc Fv-mFc融合蛋白被分泌到无血清的培养液中;免疫组化和流式结果显示,融合蛋白与表面高表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞有较强的结合能力; ADCC实验结果示融合蛋白在体外对肿瘤细胞的杀伤作用;荷瘤小鼠实验结果示融合蛋白对肿瘤的生长起到抑制作用,在5 mg/kg的药物剂量下,荷瘤小鼠瘤体体积平均增长率从14. 90%降低至3. 72%,两独立样本t检验P<0. 05,差异具有统计学意义。结论:成功制备了含单链抗体的融合蛋白,其对A549细胞具有良好的结合能力,在体内外均对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用,为研制靶向抗肿瘤药物提供实验室基础依据。
- 谈燚秦中强周万飞李红俊刘明珠许文青李正红李永海
- 关键词：重组质粒PD-L1单链抗体融合蛋白免疫抑制
- 近红外荧光蛋白和荧光素酶双标记肝细胞癌移植裸鼠模型的建立被引量：1
- 2017年
- 目的建立一种基因稳定表达,可实时监测肿瘤生长的肝癌移植瘤裸鼠模型。方法构建带有荧光素酶(Luc)和近红外荧光蛋白(iRFP)和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒,并感染HepG2肝癌细胞系,筛选得到稳定表达Luc和iRFP基因的细胞系;将细胞接种到裸鼠皮下,建立肝癌HepG2细胞移植瘤模型。利用小鼠活体成像系统检测肿瘤的生长情况,并通过HE染色及免疫组织化学染色评估肿瘤组织病理特征及成瘤能力。结果成功构建稳定表达iRFP和Luc的HepG2肝癌细胞系并建立移植瘤动物模型;模型生长周期适中,成瘤率较高;HE染色及免疫组织化学染色表现出典型的肿瘤组织病理特征。结论成功建立了稳定、可实时监测的HepG2-iRFP-Luc肝癌细胞裸鼠模型。
- 李红俊杨天华黄艳平刘明珠秦中强储菲李正红李永海
- 关键词：荧光活体成像
- 内吗啡肽-1对高糖诱导的人外周血树突状细胞成熟和TLR4表达的影响(英文)被引量：3
- 2018年
- 目的:探讨内吗啡肽-1(EM-1)对高糖诱导的人外周血来源树突状细胞(PBDC)成熟表型、细胞因子分泌、T细胞增殖和TLR4表达的影响,探讨EM-1对DC免疫功能的调节机制。方法:本研究外周血样品取自18-20岁学生志愿者,将外周血单个核细胞(PBMNC)诱导成未成熟的树突状细胞(imDC)。使用高浓度葡萄糖作为刺激因素,EM-1作为干预因素,将实验分为正常葡萄糖(NG)、高糖(HG)、加入EM-1的高葡萄糖(EM)、加入EM-1和纳洛酮的高葡萄糖(Nal)共5组。应用流式细胞术检测PBDC表型变化,ELISA检测PBDC与自体淋巴细胞共培养分泌的细胞因子的变化,CFSE法检测T淋巴细胞的增殖情况,RT-PCR法检测PBDC表面TLR4的表达。结果:与HG组比较,EM组PBDC表面分子CD86、CCR7和CD36表达上调(P<0.01),而CD83的表达无统计学意义。EM组PBDC分泌的IL-12,IL-10和PBDCs刺激的T淋巴细胞增殖指数均下降。与EM组比较,Nal组CD86,CCR7,CD36表达降低(P<0.01),而CD83表达几乎没有变化(P>0.05)。Nal组T淋巴细胞增殖指数极显著升高(P<0.01)。HG组TLR4灰度比值高于NG组,EM组明显低于HG组(P<0.01)。结果表明,高葡萄糖可以促进PBDC TLR4的表达,而EM-1抑制TLR4的表达。结论:EM-1上调高糖诱导的PBDC表面分子CD86,CCR7和CD36的表达,抑制高糖诱导的P BDC成熟。分泌的炎性细胞因子IL-12和IL-10抑制来自PBDC的T淋巴细胞的增殖,而纳洛酮抑制EM-1的作用。EM-1抑制高糖诱导的PBDC表面TLR4的表达。
- 刘传苗杨天华黄敏周诚李永海李正红
- 关键词：外周血树突状细胞高糖
- 靶向人c-Met蛋白单链抗体的制备及其对肺腺癌A549细胞的杀伤作用被引量：3
- 2018年
- 目的制备并纯化出靶向细胞间质上皮转化因子(c-Met)蛋白的人源单链抗体(scFv),鉴定其靶向c-Met蛋白的特性及其对肺腺癌细胞的作用。方法将scFv基因插入至p Fuse载体构建真核表达载体,表达融合鼠源Fc段的融合蛋白Met-scFv,经AKTA蛋白纯化系统纯化;将纯化的Met-scFv进行功能性检测:ELISA检测Met-scFv亲和力;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色检测Met-scFv识别并结合肺腺癌细胞的特性;CCK-8法检测Met-scFv对细胞增殖的影响;通过补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC),用乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂盒检测Met-scFv对靶细胞A549细胞的毒性影响。结果 ELISA结果提示,Met-scFv与c-Met呈量效关系;流式细胞术和免疫荧光细胞化学染色实验结果提示,与对照组相比,Met-scFv组信号呈阳性,提示Met-scFv与A549细胞特异性结合;Met-scFv抑制A549细胞增殖并产生细胞毒性,且毒性大小与Met-scFv剂量呈正相关。结论制备出靶向c-Met蛋白的Met-scFv,并可在体外识别并介导杀伤A549细胞。
- 刘传苗刘明珠黄艳平储菲李永海李正红
