徐晓艳
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划重庆市自然科学基金重庆市卫生局医学科研项目更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- 博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达及纯化
- 2011年
- 目的构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)磷蛋白(p24蛋白)基因重组表达质粒,原核表达p24蛋白,并进行纯化。方法通过RT-PCR法从BDV感染的少突胶质细胞株(Oligodendrocyte,OL)中扩增p24基因片段,构建重组表达质粒pET-41a-p24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达的重组蛋白进行亲和层析纯化。结果经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET-41a-p24构建正确;表达的重组p24蛋白相对分子质量约24 000,表达量占菌体总蛋白的30%以上,主要以可溶形式表达;纯化的重组蛋白纯度达85%左右,可与鼠抗BDV p24单克隆抗体特异性结合。结论已成功原核表达并纯化了重组BDV p24蛋白,为进一步建立BDV相关免疫学检测方法奠定了基础。
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- 关键词：博尔纳病病毒磷蛋白类原核细胞纯化
- 博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化
- 2011年
- 目的选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高。方法通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基氯化铵、TritonX-100、二甲亚砜和甜菜碱这4种常用的PCR添加剂,并确定各自的最佳工作浓度,选择扩增效果较好的添加剂与其他添加剂进行依次组合,寻找最佳的添加剂组合,最后用荧光定量PCR进行对比验证。结果在滴定酸上选择了效果最好的硫酸,配制TSS buffer硫酸铵的最佳终浓度为6 mmol/L。在添加剂的优化组合上,1.5 mol/L甜菜碱、0.15%Triton X-100、8 mmol/L四甲基氯化铵和TSS buffer组合成的TBTT buffer效果最佳,在其与TaKaRa PCR buffer的对比中,TBTT buffer效果明显好于后者。结论 成功研制优化出适合扩增博尔纳病病毒p24模板基因的扩增缓冲液。
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- 关键词：博尔纳病病毒
- 抗博尔纳病病毒磷蛋白多克隆抗体的制备及鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的制备抗博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)重组磷蛋白(p24)多克隆抗体,并对其进行鉴定,为BDV血清免疫学检测方法的建立奠定基础。方法用本课题组前期制备的重组BDVp24蛋白经背腿部多点皮下注射免疫新西兰大白兔,共免疫4次,末次免疫后第7天采血,分离血清,采用抗原亲和纯化法纯化抗血清,ELISA法测定抗血清效价;Western blot和免疫荧光鉴定其特异性。结果制备的抗BDV p24多克隆抗体的纯度为98%,ELISA效价达1∶128 000,该抗体与重组p24蛋白和BDV感染OL细胞表达的p24蛋白均能发生特异性反应。结论成功制备了灵敏性和特异性良好的抗BDV p24多克隆抗体,为研发相关的诊断试剂和研究该病毒的感染发病机制奠定了基础。
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- 关键词：博尔纳病病毒磷蛋白类多克隆抗体
- 两种博尔纳病病毒株持续感染PC-12细胞模型的建立被引量：3
- 2011年
- 目的构建两种博尔纳病病毒株持续感染的PC-12细胞模型,为研究博尔纳病病毒感染致病机制及比较两种病毒株致病特点的差别提供工具。方法将BDV Strain V株和Hu株分别感染PC-12细胞系,并进行传代培养,最后通过Real time FQ RT-PCR、Western blot、间接免疫荧光方法进行病毒核酸和蛋白的检测。结果在培养传代6代后,两种病毒株感染的PC-12细胞均可检测到BDV核酸及蛋白。结论 BDV Strain V株和Hu株均可在PC-12细胞中复制和表达,两种博尔纳病病毒株持续感染PC-12细胞模型构建成功。
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- 关键词：博尔纳病病毒病毒株细胞模型
- 不同血清浓度培养条件对博尔纳病病毒感染滴度的影响比较被引量：1
- 2012年
- 目的:探讨不同血清浓度对博尔纳病病毒(BDV)感染少突胶质细胞(OL细胞)感染力的影响,寻找BDV病毒感染细胞最适宜的血清浓度。方法:接种BDV的OL细胞(OL/BDV)于培养皿中,培养24小时后,通过反复冻融、超声破碎的方法获取BDV病毒液,用于感染正常的OL细胞。在保证除血清浓度因素不同而其余因素均相同的条件下,用DMEM、2%FCS、5%FCS、10%FCS四种不同浓度的血清培养基在96孔板中培养BDV新感染的OL细胞,测定病毒感染滴度,比较各组之间是否有统计学差异。结果:DMEM、5%FCS和10%FCS组所测得的BDV病毒滴度两组之间无统计学差异,2%FCS组所测得的病毒滴度和DMEM、5%FCS、0%FCS组之间有明显统计学差异,2%FCS组病毒滴度明显高于其它两组。结论:不同浓度的血清浓度对Boma病毒对细胞的感染力有影响,2%FCS的培养条件可能更适合于BDV感染OL细胞实验。
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- 关键词：博尔纳病病毒少突胶质细胞血清浓度病毒滴度
- 抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的制备和鉴定被引量：5
- 2012年
- 目的制备并鉴定鼠抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体。方法重组核蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤并进行有限稀释法克隆和亚克隆,建立分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单克隆抗体并进行效价测定和特异性鉴定。结果建立了1株能稳定分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F6E8,重链为IgG2a,轻链为κ。ELISA法测得腹水的效价高达1∶32 000以上。Western-blot和间接免疫荧光实验证实该单克隆抗体能特异性结合重组核蛋白及天然核蛋白。结论成功制备了效价高、特异性好的抗核蛋白单克隆抗体,为建立博尔纳病病毒血清免疫学检测方法奠定了基础。
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- 关键词：博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体
- 抗博尔纳病病毒核蛋白多克隆抗体的制备和鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的利用重组博尔纳病病毒核蛋白进行动物免疫,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。方法将重组载体pET14b-p40转化至感受态大肠埃希菌I,PTG诱导融合蛋白的表达,His-tag亲和层析纯化重组核蛋白并作为抗原免疫新西兰大白兔,收集免疫后血清,制备和纯化多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,并进行Western-blot鉴定。结果成功制备出核蛋白多克隆抗体,ELISA检测效价高达1︰256000;该抗体与原核和真核系统中表达的核蛋白均能发生特异性反应。结论成功制备了效价和特异性良好的抗重组核蛋白多克隆抗体,为博尔纳病病毒血清免疫学检测方法的建立奠定了基础。
- 徐晓艳金戈张亮马丽华李文娟邓婧黄荣忠房亮谢鹏
- 关键词：博尔纳病病毒核蛋白多克隆抗体
