金丽颖
- 作品数：10 被引量：4H指数：1
- 供职机构：黑龙江大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金黑龙江省教育厅科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 构建具有巨细胞病毒(CMV)启动子的杆状病毒高效表达载体并利用其在鸡胚原代细胞中表达eGFP基因被引量：1
- 2013年
- 【目的】杆状病毒载体在哺乳动物细胞中不复制,具有极高的生物安全性,而通过引入细胞特异性启动子、"病毒假型化"、添加不同功能调控元件等优化手段,杆状病毒可转导的细胞类型明显增多、转导效率明显增高。优化的重组杆状病毒可以在鸡细胞中表达,确定重组杆状病毒在鸡细胞中高效表达的条件,为禽类基因工程疫苗的开发奠定了坚实的基础。【方法】本研究以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Protein,eGFP)为报告基因,构建含巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)启动子启动的重组转座载体,并且通过病毒假型化(TM/CTD of VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs)等手段优化重组杆状病毒表达载体,最终利用重组杆状病毒对鸡胚原代细胞的侵染进行eGFP的表达,比较分析不同重组载体对蛋白表达水平的影响。【结果】eGFP表达结果显示,12 h便可在倒置荧光显微镜下检测出eGFP的表达,随着时间的延长,eGFP表达效率先增加后降低。经过VSVGED病毒假型化的重组杆状病毒转导效率从36%增加至48.2%。添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加10mmol/L丁酸盐法基本相同,但对细胞几乎没有毒性。从72 h内的eGFP表达强度看,只有添加ITRs元件的重组杆状病毒的表达强度随时间的延长而极缓慢增加。【结论】eGFP表达结果显示,利用VSVGED病毒假型化手段可以提高杆状病毒转导鸡胚原代细胞的效率;添加转录后调控元件WPRE的重组杆状病毒介导eGFP的表达效果与添加丁酸盐法基本相同,可以增强杆状病毒介导报告基因在鸡胚原代细胞中的表达水平;添加ITRs元件的重组杆状病毒具有延长eGFP表达时间的作用。
- 宋姗姗葛菁萍李梅高冬妮金丽颖安琦平文祥楼庄伟
- 关键词：杆状病毒调控元件
- HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
- HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题。方法：一、以pMD18-T-VP2为模板进行PCR扩增，获得目的...
- 葛菁萍高冬妮宋刚凌宏志平文祥楼庄伟唐晓艳金丽颖安琪田兆峰
- 文献传递
- 鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株全基因组的克隆与分子系统进化树分析
- 2013年
- 为了获得鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株的全基因组cDNA,确定其分子进化关系。以IBDV J1C7株细胞培养液为材料,用蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取IBDV基因组dsRNA,利用特异性引物将基因组A、B节段分两段进行RT-PCR并通过融合PCR方法将具有部分重叠序列的A、B节段的上、下游基因组进行拼接,从而构建出完整的A、B节段基因组,利用pMD-18T载体快速克隆PCR产物。结果表明：获得了3260 bp的A节段全长（Genbank登录号EF646854）和2827 bp的B节段全长（Genbank登录号EF646853）。氨基酸同源性比对结果表明：J1C7株与弱毒疫苗株CEF94（芬兰）、P2（德国）、JD1（中国）、HZ2（中国）的亲缘关系最近（蛋白同源性为VP5：99.3%;VP2：99.3%~100%;VP4：97.9%~99.2%;VP3：96.4%~98.1%;VP1：99.2%~99.9%）。BDV J1C7株属于弱毒疫苗株,且与欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系,在进化树上归为一簇。本研究为构建IBDV的感染性cDNA,了解IBDV基因组的结构与功能打下了基础。
- 高冬妮金丽颖安琦申燕平文祥葛菁萍
- 关键词：传染性法氏囊病病毒融合PCR
- 鸡新城疫病毒F基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2014年
- 研究旨在从分子生物学角度研究新城疫病原F基因,探究NDVF基因的遗传变异情况及其蛋白结构。提取新城疫病毒基因组RNA,根据GenBank中已知的NDVLa Sota株序列设计引物扩增F基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-NDV-F进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒F基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、蛋白结构跨膜区分析及F蛋白三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明:F基因为1792 bp,共编码553个氨基酸;生物信息学分析结果表明:F基因在种属间具有较高的保守性,试验获得的F基因与NDV La Sota、Clone30、V4、B1等弱毒株的一致性较高,具有典型的弱毒株特性,F基因的氨基酸序列与新城疫病毒La Sota株F基因的序列同源性最高可达100%;F蛋白的三级结构预测结果显示:F蛋白部分片段与新城疫病毒F蛋白融合片段的相似性为96%。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。
- 安琦申燕原韬刘颖金丽颖高冬妮葛菁萍平文祥
- 关键词：新城疫病毒F基因RT-PCR
- 以具有WPRE调控元件的杆状病毒为载体在鸡胚原代细胞中表达新城疫病毒F基因被引量：1
- 2014年
- 【目的】构建具有哺乳动物细胞特异性启动子和基因转录后调控元件的重组杆状病毒转移载体,优化的重组杆状病毒可介导新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因在鸡原代骨骼肌细胞中进行高效表达。【方法】提取NDV La Sota株病毒RNA基因组,用RT-PCR技术扩增F基因,将其克隆到自主构建的具有转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)的杆状病毒转移载体的CMV启动子下游,通过Bac-to-Bac系统获得F重组Bacmid,经转染Sf9昆虫细胞后获得F重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72 h后裂解细胞收获蛋白。比较分析WPRE调控元件对蛋白表达水平的影响。【结果】经Western blot证实在鸡原代骨骼肌细胞中表达了NDV F蛋白,分子量约56 kDa,与预测蛋白大小一致,且能被NDV阳性血清所识别。添加WPRE转录后调控元件的重组杆状病毒介导F蛋白的表达效果与添加10 mmol/L丁酸盐法基本相同,但对细胞几乎没有毒性。【结论】优化后的重组杆状病毒可以向鸡原代细胞中传递NDV F基因,并在CMV的启动下表达具有反应原性的F蛋白,添加的转录后调控元件WPRE可以增强杆状病毒介导外源基因在鸡原代细胞中的表达水平。本研究为研制NDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体基因工程疫苗奠定了基础。
- 高冬妮平文祥金丽颖沈万力宋刚唐晓艳安琦申燕葛菁萍
- 关键词：新城疫F基因杆状病毒
- EF1α启动的高效重组杆状病毒载体的构建及其表达效果被引量：2
- 2014年
- 【目的】通过选用哺乳动物细胞特异性启动子—人类延伸因子1α启动子(Elonggation factor 1αpromoter,EF1-α)、利用病毒假型化工具—截断型水疱型口膜炎病毒G蛋白(Truncated Vessicular stomatitis virus protein G,VSV-GED)、添加转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)和腺病毒反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITRs),来提高杆状病毒的转导效率及外源基因的表达水平。【方法】从pFB-VSV-GED-WPRE出发构建含EF1α启动子的2个重组杆状病毒转移载体pWK和pWK-ITR。再以增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)基因为报告基因插入EF1α启动子的下游,构建重组转移载体pWK-eGFP和pWK-ITR-eGFP以及阴性对照pWK(-)-eGFP。将构建好的重组质粒转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒,侵染少突神经胶质细胞(OL细胞)后,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】含有WPRE和ITRs的病毒BV-WK-eGFP、BVWK-ITR-eGFP荧光表达率明显高于阴性对照,且ITRs能够有效延长eGFP的表达时间,比对照组BV-WK(-)-eGFP延长了72 h。经VSV-GED假型化的杆状病毒BV-WK-eGFP、BV-WK-ITR-eGFP转导OL细胞的时间明显缩短,比阴性对照BV-WK(-)-eGFP减少了24 h,并且转导效率分别高出阴性对照25.7%与36.5%。【结论】实验证明了VSV-GED能够有效提高杆状病毒的转导效率,WPRE能够显著增强外源基因的表达效率,ITRs延长外源基因的表达时间。为探究改进型重组杆状病毒在脊椎动物细胞表达外源基因及新型重组活载体疫苗的研发奠定了基础。
- 高冬妮金丽颖葛菁萍王昆安琪平文祥楼庄伟
- 关键词：杆状病毒
- 具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法
- 具有CMV启动子的可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法，涉及可表达EGFP的重组杆状病毒的构建方法。方法：酶切pcDNA3.1(-)；酶切pFastBac1；二者连接得pFastBac1-pcDNA3.1(-)；pEG...
- 葛菁萍高冬妮宋刚凌宏志平文祥楼庄伟唐晓艳安琪金丽颖
- 文献传递
- 新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析
- 2015年
- 旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。
- 刘颖金丽颖申燕高冬妮平文祥葛菁萍
- 关键词：新城疫病毒HN基因基因克隆
- 构建表达新城疫病毒F、HN基因重组杆状病毒及其免疫效果的研究
- 新城疫(Newcastle disease,ND)是一种由副粘病毒科新城疫病毒(Newcastle diseas virus,NDV)引起的禽类致死性传染病,该病具有发病急、死亡率高等特点,严重危害了我国养禽业。F蛋白是...
- 金丽颖
- 关键词：新城疫病毒F基因HN基因免疫原性
- 文献传递
- HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
- HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前新城疫的病毒疫苗存在成本高的问题。方法：一、以pNDV-F-T为模板PCR扩增，目的片段进行TA克隆及连接，得pTY...
- 葛菁萍高冬妮宋刚凌宏志平文祥楼庄伟唐晓艳金丽颖安琪叶磊
- 文献传递
